電離輻射對Beclin 1過表達和低表達MCF-7細胞模型細胞自噬和凋亡的影響及其調控機制

張 　晶，趙大力，謝忠偉，劉彥軍，李志君，李　巖，龔守良，齊亞莉

(1. 北華大學公共衛生學院流行病學教研室，吉林 吉林 132011；2. 吉林(市)出入境檢驗檢疫局，吉林 吉林132012；3. 吉林省長春市人民醫院腫瘤治療科，吉林 長春 130051； 4.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021)

電離輻射對Beclin 1過表達和低表達MCF-7細胞模型細胞自噬和凋亡的影響及其調控機制

張 晶1，趙大力2，謝忠偉2，劉彥軍3，李志君1，李巖1，龔守良4，齊亞莉1

(1. 北華大學公共衛生學院流行病學教研室，吉林 吉林 132011；2. 吉林(市)出入境檢驗檢疫局，吉林 吉林132012；3. 吉林省長春市人民醫院腫瘤治療科，吉林 長春 130051； 4.吉林大學公共衛生學院 衛生部放射生物學重點實驗室，吉林 長春 130021)

目的：建立Beclin 1過表達和低表達MCF-7細胞模型，檢測4 Gy照射后細胞自噬和凋亡的變化，探討Beclin 1的分子調控作用機制。方法：實驗分為MCF-7組、MCF-7+4 Gy組、MCF-7-Beclin1+4 Gy組和MCF-7-Belin1 RNAi+4 Gy組。利用分子生物學方法構建Beclin 1過表達載體pcDNA3.1-Beclin 1，并建立Beclin 1過表達和低表達細胞模型。細胞經4 Gy照射后，采用MDC染色熒光顯微鏡觀察自噬細胞百分比，AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式細胞術檢測凋亡細胞百分比，Western blotting法檢測Beclin 1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表達。結果：與MCF-7組比較，MCF-7+4 Gy組、MCF-7-Beclin 1+4 Gy組和MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy組自噬和凋亡細胞百分比均明顯升高(P<0.05 或P<0.01)，以MCF-7-Beclin 1+4 Gy組升高最明顯，且高于MCF-7+4 Gy組 (P<0.05)；各組壞死細胞百分比無明顯差異。4 Gy照射后，MCF-7組和MCF-7-Beclin 1組細胞中Beclin 1、P53和Bax蛋白表達水平均升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，且以MCF-7-Beclin 1組最為明顯。結論：成功建立Beclin 1過表達和低表達MCF-7細胞模型，電離輻射能夠誘導其細胞自噬和凋亡，且對Beclin 1過表達細胞作用更明顯。Beclin1通過激活P53，進而抑制Bcl-2和激活Bax，從而形成以P53為中心的自噬與凋亡分子調控機制。

自噬；細胞凋亡；電離輻射；Beclin 1；P53

乳腺癌放射治療是臨床上常用的治療方式。實際上，在放療誘導乳腺癌細胞凋亡過程中，常會出現腫瘤細胞的輻射耐受現象和腫瘤細胞逃逸凋亡，達不到理想的治療效果。自噬(autophagy)是另一種程序化細胞死亡方式，是真核細胞蛋白降解的重要途徑，受諸如輻射等多種外來因素刺激而發生[1-4]。自噬涉及到許多調控分子，形成龐大的網絡系統。Beclin 1基因是抑癌基因，可以參與自噬體的形成，有利于吞噬泡的聚集和組裝；同時，還有利于自噬體的成熟，進而影響腫瘤的發生和發展[5-6]。P53可與Beclin 1相互作用，共同決定腫瘤細胞的命運[7]；并且，P53與Bcl-2家族共同參與細胞凋亡的調控。本研究探討Beclin 1通過激活P53，進而抑制Bcl-2和激活Bax，從而形成以P53為中心的自噬與凋亡分子調控機制，為乳腺癌放射治療提供新的靶點和思路。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人乳腺癌MCF-7細胞系和人源胚胎腎293T細胞系由本室保存，以10%胎牛血清的高糖DMEM(Gibco公司，美國)培養于37℃、5% CO2環境中。pSuper-Beclin 1質粒(吉林大學公共衛生學院放射生物教研室劉曉冬博士惠贈)。RT-PCR試劑盒為大連寶生物公司產品；轉染試劑為Lipofectamine 2000(Inventrogen公司，美國)；puromycin用于RNAi穩定細胞模型篩選(Sigma公司，美國)；一抗包括GAPDH-、Bcl-2-和Bax-Mouse IgG，Beclin 1- 和p53-Rabbit IgG(Santa Cruz公司，美國)；二抗為辣根過氧化物酶標記的Mouse IgG和Rabbit IgG(Santa Cruz公司，美國)；單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)(Sigma公司, 美國)；Annexin Ⅴ-FITC試劑盒(BD公司，美國)；其他試劑均為國產分析純。國產X射線深部治療機(XSZ-Z20/20型，丹東)，熒光顯微鏡(Olympus公司，日本), 凝膠成像分析系統(Bio-Rad，美國), 流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.2Beclin 1過表達和低表達細胞模型建立根據基因克隆中重組載體的方法，采用RT-PCR方法克隆Beclin 1片段(GenBank：003766)、Beclin 1上游引物：5′-GCGAATTCATGGAAGGGTCTA-

AGACGTCCAACAACA -3′(含EcoR Ⅰ酶切位點)，下游引物：5′-GCGGATCCTCATTTGTTATAAAATTGTGAGGACACCC-3′(含BamHⅠ酶切位點)。瓊脂糖凝膠電泳后，回收DNA片段，并與pcDNA 3.1載體分別進行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收載體片段后，利用T4 DNA ligase在16℃條件下，過夜連接，并轉化，挑取單克隆進行測序鑒定。將pcDNA 3.1-Beclin 1載體利用Lipofectamine 2000瞬時轉染到MCF-7細胞中，并進行G418篩選(濃度為275 mg·L-1)，獲得穩定Beclin 1過表達細胞模型MCF-7-Beclin 1。利用Western blotting法檢測Beclin 1蛋白的表達，與內參GAPDH進行灰度比較。利用磷酸鈣共沉淀轉染法轉染293T細胞，經過puromycin(1 mg·L-1)篩選獲得病毒，病毒感染MCF-7細胞后，進行puromycin(1 mg·L-1)篩選，獲得 Beclin 1低表達細胞模型MCF-7-Beclin 1 RNAi。

1.3實驗分組和照射方法實驗分為MCF-7組、MCF-7+4 Gy組、MCF-7-Beclin 1+4 Gy組和MCF-7-Belcin 1 RNAi+4 Gy組。應用X射線深部治療機進行照射，照射條件為電壓200 kV，電流18 mA，劑量率為0.342 Gy · min-1。

1.4MDC染色檢測細胞自噬將3種細胞系分別按照0.1 × 106mL-1接種于含有無菌玻片的6孔板中，待細胞80%～90%融合后進行4 Gy照射，12 h后用0.01 mmol·L-1PBS洗2次，加100 μL 的50 mmol·L-1MDC，37℃溫育1 h，棄掉MDC染液后用0.01 mmol·L-1PBS洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，取細胞爬片、封片、晾干，采用熒光顯微鏡進行觀察，每個細胞超過8個自噬小點為細胞自噬，共觀察150個細胞，并計算自噬百分比(%)。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡將3種細胞系分別按照2×105mL-1接種于24孔板，待細胞80%～90%融合后進行4 Gy照射，12 h后收集細胞，0.01 mmol·L-1PBS洗3次，600 μL的緩沖液重懸細胞后，再加5 μL Annexin Ⅴ-EGFP和5 μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)，充分混合后37℃避光30 min，流式細胞儀檢測凋亡細胞百分比(%)。

1.6Western blotting法檢測Beclin 1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表達將各實驗組按照1 × 106mL-1細胞接種于60 mm培養皿，待細胞80% ～ 90%融合后進行4 Gy照射，12 h后利用PBS收集細胞，加入100 μL裂解液RIPA提取總蛋白，上樣10 μL，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后采用含5%脫脂奶粉的PBS封閉。1 h后在4℃用一抗孵育過夜。含0.05%Tween 20的TBST緩沖液洗2次以移除未結合一抗，采用辣根過氧化物酶標記的二抗37℃孵育1 h，抗原抗體復合物采用化學發光試劑(electrochemiluminescence，ECL)進行顯像，拍照，并與內參GAPDH進行灰度比較。

2　結　果

2.1pcDNA3.1-Bcelin 1載體酶切鑒定利用RT-PCR法獲得Beclin 1的DNA片段。由圖1可見：瓊脂糖凝膠電泳后，泳道1可見約1 353 bp的片段，回收后經過EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，連到經過相同雙酶切的pcDNA 3.1載體上，小提質粒后，經過EcoRⅠ 和BamHⅠ雙酶切鑒定，泳道2為pcDNA 3.1原質粒，而泳道3～6均為pcDNA 3.1-Beclin 1質粒，均可見大小為1 353 bp的片段，說明所挑取的4個單克隆均正確，選取其中1個送大連寶生物公司測序，所得序列與GenBank中公布的序列完全一致，質粒構建正確。

M: DL 2000 marker Lane 1: Beclin 1 PCR production;Lane 2: pcDNA3.1-Beclin 1 plasmid;Lane 3-6: pcDNA3.1-Beclin 1 digested byEcoRⅠ andBamHⅠ.

圖1 Beclin 1片段PCR擴增及pcDNA3.1質粒雙酶切鑒定電泳圖

Fig.1Electrophoretogram of Beclin 1 PCR product and pcDNA3.1-Beclin 1 identifid by double enzyme digestion

2.2Beclin 1-MCF-7和Beclin 1 RNAi-MCF-7細胞系中Beclin 1蛋白表達將獲得的穩定細胞模型Beclin 1-MCF-7和Beclin 1 RNAi-MCF-7細胞提取總蛋白，利用Western blotting法檢測Beclin 1蛋白的表達。由圖2可見：泳道2和4分別為過表達和低表達空載體對照細胞，Beclin 1蛋白表達未見明顯改變；而泳道3為Beclin 1過表達細胞，Beclin 1表達增加；泳道6為Beclin 1低表達細胞，Beclin 1表達顯著降低。

Lane 1: MCF-7; Lane 2: MCF-7-pcDNA3.1; Lane 3: MCF-7-Beclin 1;Lane 4: MCF-7; Lane 5: MCF-7-Psuper Retro; Lane 6: MCF-7 -Beclin 1 RNAi.

圖2Western blotting法檢測MCF-7細胞模型中Beclin 1過表達和低表達

Fig.2Beclin 1 over- and low-expressions in MCF-7 cell models detected by Western blotting method

2.3自噬、凋亡和壞死細胞百分比與MCF-7組比較，MCF-7+4 Gy組、MCF-7-Beclin 1+ 4 Gy組和MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy組自噬細胞百分比明顯升高(P<0.05 或P<0.01)，以MCF-7-Beclin 1+4 Gy組升高最明顯，且顯著高于MCF-7+4 Gy組(P<0.01)。與MCF-7組比較，MCF-7+4 Gy組、MCF-7-Beclin 1+4 Gy組和MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy組凋亡細胞百分比均明顯升高(P<0.01)，以MCF-7-Beclin 1+4 Gy組升高最明顯，且顯著高于MCF-7+4 Gy組(P< 0.05)。各組壞死細胞百分比則無明顯差異。見表1。

表14 Gy照射后12 h各組自噬、凋亡和壞死細胞百分比

Tab.1 Autophygic, apoptotic and necrotic percentages of cells 12 h after 4 Gy irradiation in various groups

±s,η/%)

*P<0.05,**P<0.01vsMCF-7;△P<0.05,△△P<0.05vsMCF-7+4 Gy group.

2.4各組細胞中P53、Bcl-2和Bax蛋白表達4 Gy照射能夠誘導MCF-7和MCF-7-Beclin 1細胞Beclin 1表達增加，且MCF-7-Beclin 1細胞增加明顯；能夠誘導MCF-7和MCF-7-Beclin 1細胞P53蛋白表達增加，但是MCF-7-Beclin 1 RNAi細胞P53蛋白表達降低；同時也能夠誘導MCF-7、MCF-7-Beclin 1和MCF-7-Beclin 1 RNAi細胞Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，以MCF-7-Beclin 1細胞變化最為明顯。見圖3。

Lane 1: MCF-7 group; Lane 2: MCF-7+4 Gy group; Lane 3: MCF-7-Beclin 1+4 Gy group; Lane 4: MCF-7-Beclin1 RNAi+4 Gy group.

圖3Western blotting法檢測4 Gy照射后各組細胞中Beclin 1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表達

Fig.3Expressions of Beclin 1, P53, Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups after 4 Gy irradiation detected by Western blotting method

3　討　論

自噬是一種Ⅱ型程序性細胞死亡，有利于清除細胞內多余蛋白質，同時對于降解細胞內損害的細胞器，如內質網、高爾基體和線粒體具有重要作用。自噬對于腫瘤具有雙重作用，既可以通過清除腫瘤細胞代謝垃圾起到保護作用，又在一些腫瘤治療中細胞逃避凋亡后可以發生細胞自噬，有利于增強腫瘤的放射敏感性[8]。目前，已有許多實驗研究[9-10]證實：電離輻射能誘導細胞發生自噬和自噬小體的聚集。電離輻射聯合mTOR抑制劑雷帕霉素在乳腺癌細胞MCF-7中可以促使細胞質成分被隔離入自噬性囊泡中，輻射可以改變線粒體代謝引起超極化及促使P53蛋白磷酸化等，直至最終發生自噬[11]。而凋亡是Ⅰ型程序性細胞死亡，電離輻射誘導腫瘤細胞DNA損傷后，可激活毛細血管擴張失調癥突變激酶(ATM)，可使P53第15位上絲氨酸殘基磷酸化，后者激活后可以通過線粒體和死亡受體2種不同途徑最終引發caspases 級聯反應，導致腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示：4 Gy照射后可以增加MCF-7細胞自噬和凋亡百分比，而對壞死百分比則無明顯影響，這揭示了電離輻射對乳腺癌細胞MCF-7殺傷主要以自噬和凋亡形式，而非壞死性死亡。

另外，腫瘤細胞中自噬和凋亡不是孤立存在的，而是具有某種聯系，重疊部分在特定條件下可以轉化。兩型細胞死亡之間的具體轉化機制還不清楚，只是線粒體可能涉及凋亡和自噬2種作用的整合。自噬誘導蛋白和凋亡相關蛋白之間存在直接的物理作用，如P53和Beclin 1等。Son等[12]研究發現：Beclin 1可以通過提高caspase-9活性，進而增強凋亡誘導劑誘發的凋亡；Bcl-2家族蛋白既能抑制凋亡又能抑制自噬[13]，進一步提示了兩者之間的密切關系。P53可以與Beclin 1相互作用，共同決定腫瘤細胞的命運[7]。并且，P53與Bcl-2家族共同參與細胞凋亡的調控，Beclin1激活P53，進而抑制Bcl-2和激活Bax，從而形成以P53為中心的自噬與凋亡分子調控通路。本研究結果顯示：當Beclin 1過表達時，給予4 Gy照射，明顯增加了自噬和凋亡細胞百分比，并且P53和Bax蛋白表達明顯增加，而Bcl-2蛋白明顯減少；當Beclin 1低表達時，給予4 Gy照射，自噬細胞百分比和凋亡細胞百分比雖然較MCF-7明顯升高，但較單純4 Gy照射升高不多，提示Beclin 1過表達可以顯著影響輻射誘導的自噬和凋亡，是輻射誘導自噬和凋亡的重要分子，并且可以通過P53抑制Bcl-2和激活Bax通路，介導自噬和凋亡。

綜上所述，Beclin 1基因作為重要的自噬調節基因之一，能夠介導自噬蛋白定位到前自噬小體，而p53基因作為“分子警察”可能通過促進Beclin 1基因的表達，促進自噬性囊泡的形成，進而引起自噬的發生[14-16]。目前，在臨床上腫瘤放療和化療大多是圍繞誘導腫瘤細胞凋亡展開的，但腫瘤細胞對放療和化療耐受的問題很棘手。本研究以Beclin 1為靶點，研究電離輻射后其過表達可誘導自噬和凋亡均增加，這為腫瘤放療研究提供一個新的靶點和思路。

[1]Li W, Yang Q, Mao Z. Chaperone-mediated autophagy: machinery, regulation and biological consequences [J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(5):749-763.

[2]Sahu R, Kaushik S, Clement CC, et al. Microautophagy of cytosolic proteins by late endosomes [J]. Dev Cell, 2011, 20(1):131-139.

[3]Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, et al. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis [J]. Cell Death Differ, 2011, 18 (4):571-580.

[4]Choi J, Jung W, Koo JS. Expression of autophagy-related markers beclin-1, light chain 3A, light chain 3B and p62 according to the molecular subtype of breast cancer [J].Histopathology, 2013, 62(2):275-286.

[5]Huang X, Bai HM, Chen L, et al. Reduced expression of LC3B-II nd Beclin 1 in glioblastoma multiforme indicates a down-regulated autophagiccapacity that relatesto the progression of astrocytic tumors [J]. J Clin Neurosci, 2010, 17(12):1515-1519.

[6]Chen S, Jiang YZ, Huang L, et al. The residual tumor autophagy marker LC3B serves as a prognostic marker in local advanced breast cancer after neoadjuvant chemotherapy [J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(24):6853-6862.

[7]Tripathi R, Ash D, Shaha C. Beclin-1-p53 interaction is crucial for cell fate determination in embryonal carcinoma cells [J]. J Cell Mol Med, 2014,18(11):2275-2286.

[8]Mujumdar J, Nameeta M, Saluja L. Autophagy in pancreatic cancer: an emerging mechanism of cell death [J]. Autophagy, 2010, 6(7):997-998.

[9]Singh P, Godbole M, Rao G, et al. Inhibition of autophagy stimulate molecular iodine-induced apoptosis in hormone independent breast tumors [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 415(1):181-186.

[10]Tian W, Chen SY. Recent advances in the molecular basis of anti-neoplastic mechanisms of oridonin [J]. Chin J Integr Med, 2013,19(4):315-320.

[11]Eisenberg-Lerner A, Bialik S, Simon HU, et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them [J]. Cell Death Differ, 2009, 16 (7):966-975.

[12]Son M, Lee S, Byun Y, et al. Sodium nitroprusside induces autophagic cell death in glutathione-depleted osteoblasts [J]. J Biochem Mol Toxicol, 2010, 24(5):313-322.

[13]Mestre MB, Fader CM, Sola C, et al. Alpha-hemolysin is required for the activation of the autophagic pathway in Staphylococcus aureus-infected cells [J]. Autophagy, 2010, 6 (1):110-125.

[14]Zhang YH, Wu YL, Tashiro SI, et al. Involvement of PKC signal in oridonin-induced autophagy in HeLa cells: A protective mechanism against apoptosis [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 378(2):273-278.

[15]Xie T, Li SJ, Guo MR, et al. Untangling knots between autophagic targets and candidate drugs, in cancer therapy [J]. Cell Prolif, 2015, 48(2):119-139.

[16]Lee SW, Kim HK, Lee NH, et al. The synergistic effect of combination temozolomide and chloroquine treatment is dependent on autophagy formation and p53 status in glioma cells [J]. Cancer Lett, 2015, 360(2):195-204.

Effects of ionizing radiation on autophagy and apoptosis in MCF-7 cells with Beclin 1 over- and low-expressions and their regulating mechanisms

ZHANG Jing1, ZHAO Dali2, XIE Zhongwei2, LIU Yanjun3, LI Zhijun1, LI Yan1, GONG Shouliang4, QI Yali1

(1. Department of Epidemiology, School of Public Health, Beihua University, Jilin 132001, China; 2. Jilin Province (City) Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jilin 132012, China; 3. Department of Radiotherapy,People’s Hospital in Changchun City, Jilin Province, Changchun 130051, China; 4. Key Laboratory of Radiobiology, Ministry of Health, School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo establish the MCF-7 cell models of Beclin 1 over- and low-expressions, and to detect the autophagic and apoptotic changes after 4 Gy irradiation, and to explore their molecular regulation mechanisms. MethodsMCF-7,MCF-7+4Gy,MCF-7-Beclin 1+4Gy and MCF-7-Belcin 1 RNAi+4Gy groups were set up. Molecular biology method was used to construct Beclin 1 over-expression vector pcDNA3.1-Beclin 1, and to estabilish the Beclin 1 over- and low-expression cell models. After the cells were irradiated with 4 Gy, the autopahgic cell percentages were measured by fluorescence microscope with MDC staining, the apoptotic cell percentages were measured by FCM with AnnexinⅤ-FITC and PI staining, and the expressions of Beclin1, P53, Bcl-2 and Bax proteins were measured by Western blotting method. ResultsCompared with MCF-7 group, the autophagic and apoptotic cell percentages in MCF-7+4 Gy, MCF-7 Beclin 1+4 Gy and MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy groups were significantly increased (P<0.05 orP<0.001 ), especially in MCF-7 Beclin 1+4 Gy group which was significantly higher than those in MCF-7+4 Gy (P<0.05); while there was significant difference in the necrotic cell percentages between various groups. After 4 Gy irradiation, compared with MCF-7 group, the expression levels of Beclin 1, P53 and Bax proteins in MCF-7+4 Gy and MCF-7-Beclin 1+4 Gy groups were increased, but the expression levels of Bcl-2 protein were decreased, especially in MCF-7-Beclin 1+4 Gy group. ConclusionThe MCF-7 cell models of Beclin 1 over- and low-expressions are successfully established, and ionizing radiation could induce the autophagy and apoptosis of MCF-7 cells, which is more obvious in Beclin 1 over-expression MCF-7 cells. Beclin 1 can activate P53, inhibit Bcl - 2 and activate Bax,which forms the regulation of autophagy and apoptosis by P53 .

autophagy; aopotosis; ionizing radiation; Beclin 1; P53

1671-587Ⅹ(2015)06-1139-05

10.13481/j.1671-587x.20150608

2015-09-09

國家自然科學基金資助課題(30970681)；吉林省教育廳“十二五”科學技術研究項目資助課題(2014-192)

張晶(1973-)，女，吉林省九臺市人，講師，醫學碩士，主要從事細胞毒理學方面的研究。

齊亞莉，副教授，碩士研究生導師(Tel:0432-64608343，E-mail:374494617@qq.com)

R818

A