不可逆性電穿孔介導HPV16 E6 shRNA干擾質粒對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

王智亮，余騰驊，秦　琴，吳雨桐，張文倩，華媛媛，熊正愛，周　瑋

(1. 重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科，重慶 400010；2. 重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶 400016；3.重慶市婦幼保健院產科，重慶 400013)

不可逆性電穿孔介導HPV16 E6 shRNA干擾質粒對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響

王智亮1，余騰驊2，秦琴1，吳雨桐1，張文倩1，華媛媛1，熊正愛1，周瑋3

(1. 重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科，重慶 400010；2. 重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌乳腺外科，重慶 400016；3.重慶市婦幼保健院產科，重慶 400013)

目的:探討利用治療劑量脈沖電場產生不可逆電穿孔(IRE)介導HPV16 E6 shRNA干擾質粒進入細胞的可行性，闡明二者共同作用對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響及其作用機制。方法:將HPV16 E6基因特異性干擾序列插入pGenesil-1質粒,構建HPV16 E6 shRNA真核表達載體，將10個電壓為800 V、脈寬100 μs、頻率1 Hz的IRE作用于SiHa細胞與HPV 16 E6 shRNA干擾質粒的混懸液，根據處理因素組合，分為空白對照組、IRE處理組、pGenesil-N組、pGenesil-N+IRE組、pGenesil-E6組和pGenesil-E6+IRE組。在熒光顯微鏡下觀察SiHa細胞綠色熒光蛋白(GFP)的表達，計算GFP表達效率；RT-PCR法檢測HPV 16 E6 mRNA表達水平，Western blotting法檢測HPV16 E6蛋白、P53及PCNA蛋白表達水平，CCK-8法檢測各組SiHa細胞增殖能力的變化。結果:成功構建HPV16 E6 shRNA真核表達載體，IRE處理后24 h細胞即可見到綠色熒光；與IRE組比較,pGenesil-E6+IRE組E6 mRNA表達水平下降(P<0.05)，E6蛋白表達水平降低(P<0.05)，P53蛋白表達水平增高(P<0.05)，PCNA表達水平下降(P<0.05)；CCK-8法檢測，與pGenesil-E6組比較，pGenesil-E6+IRE組細胞增殖活性下降更明顯(P<0.05)。結論:治療劑量的IRE可介導外源基因進入細胞，二者聯合作用能明顯抑制宮頸癌SiHa細胞增殖。

電穿孔；干擾質粒；宮頸腫瘤；細胞增殖

對脈沖電場(pulsed electric fields,PEF)的各參數(電場強度、脈沖寬度、脈沖頻率和脈沖個數)進行不同調節及組合，可以實現電化學治療(electrochemtherapy，ECT)、電基因治療(electrogenetherapy，EGT)以及不可逆性電穿孔(irreversible electroporation，IRE)等作用[1]。外加較低場強電場作用于細胞，細胞膜脂質雙分子層上形成可逆性“小孔”(可逆性電穿孔，reversible electroporation， RE)，當電場參數達到一定閾值時，形成“永久性孔道”，細胞發生凋亡、壞死，即IRE，這是利用IRE進行腫瘤治療的基礎[2]。IRE對腫瘤的殺傷作用具有劑量依賴性[3]，隨著組織對電場能量的沉降，遠離針極中心的組織所承受的電場強度降低，僅能發生RE[4]，能量不足以殺傷細胞。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)編碼的E6可以與抑癌基因p53結合，使抑癌蛋白喪失功能，導致細胞生長失控，并逐步演變成侵襲性宮頸癌[5]?；螂娹D染(electrogene transfer)作為一種細胞轉染的物理方法，與病毒載體轉染法相比，具有無免疫原性和無突變風險[6]。為保證轉染后細胞活力，其所需電場場強較低，在多種上皮性腫瘤細胞中為200～300 V·cm-1[7]，而這恰好在IRE靶區外場強衰減范圍(RE區域)內。Au等[4]率先在動物研究中證實:經門靜脈大劑量團注質粒對豬肝實施IRE后，豬膽囊內可觀察到綠色熒光，表明IRE可介導質粒進入肝細胞。但目前尚無治療劑量IRE聯合干擾質粒治療腫瘤的可行性研究報道。因此，本研究擬以HPV16病毒陽性的宮頸癌SiHa細胞為研究對象，探討以治療劑量的IRE殺傷腫瘤細胞時，充分利用RE區域介導靶向HPV16病毒E6基因干擾質粒的可行性，闡明二者共同作用對于SiHa細胞增殖的影響及其可能的機制。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器宮頸鱗癌細胞株SiHa(HPV16型病毒陽性)由重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科實驗室提供；DMEM(高糖)培養基、胎牛血清和0.125%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)，質粒載體pGenesil-1和質粒抽提純化試劑盒(北京鼎國昌盛有限公司)，試劑盒反轉錄試劑盒2×Mix (大連寶生物公司)，HPV16 E6蛋白抗體(兔抗人)(美國Santa Cruz公司)，兔抗人PCNA和p53抗體(博奧森公司)，Lipofecter脂質體轉染試劑(碧云天生物技術研究所)；脈沖電場腫瘤治療儀(重慶大學輸配電裝備及系統安全與新技術國家重點實驗室研制，專利號：ZL20071007828 2.7)，電擊小室(美國BIO-RAD公司)。

1.2HPV16 E6干擾質粒的構建與鑒定根據已知文獻[8]中關于HPV 16 E6基因的有效siRNA靶序列，選擇HPV 16型病毒E6蛋白的基因序列(Gene ID:1489078)第377～395核苷酸為HPV16E6靶序列小干擾RNA：5′-UACAACAAACCGUUGUGUG-3′；同時設計1條經Blast檢索與現有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列作為陰性對照序列：5′-GCAGATAGGTAGGCGTTAT-3′。上述2條序列分別命名為HPV16 siE6和HPV16 siN(negative)。HPV16 siE6引物正義鏈：5′-GATCCGGGAATCCATATGCTGTATTTCAAGAGAATACAGCATATGGA-

TTCCCTTTTTTA-3′，反義鏈：5′-AGCTTAAA-

AAAGGGAATCCATATGCTGTATTCTCTTGA-

AATACAGCATATGGATTCCCG-3′。將HPV16 E6基因特異干擾序列構建入pGenesil-1質粒。將單鏈目的序列片段退火形成的雙鏈與經BamH和Hind 雙酶切后的質粒pGenesil-1用T4連接酶連接，轉化DH5α感受態細胞，經擴大培養、質粒提取、酶切鑒定與測序(上海生工生物工程技術公司)，將二者分別命名為pGenesil-E6和pGenesil-N(陰性質粒)。通過鑒定的質粒，擴大培養后提取質粒備用。

1.3細胞培養SiHa細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基(37℃、5%CO2飽和濕度)中。

1.4細胞IRE及分組選取指數生長期SiHa細胞，用無血清DMEM培養基重懸，調整密度為2×106mL-1。細胞分為6組：空白對照組、IRE處理組、pGenesil-N組、pGenesil-N+IRE組、pGenesil-E6組和pGenesil-E6+IRE組。其中，IRE處理組、pGenesil-N+IRE組和pGenesil-E6+IRE組按如下步驟操作：將細胞懸液加入電轉杯中，體積為500 μL，分別加入相應質粒20 μg，吹打均勻。處理參數：電壓800 V、脈寬100 μs、頻率1 Hz，脈沖個數10個。處理后電轉杯置于37℃細胞孵箱孵育10 min。將細胞懸液轉移至6孔板中，加入完全培養基2 mL，6 h后更換完全培養基。空白對照組、pGenesil-N組和pGenesil-E6組，提前1 d進行6孔板鋪板，IRE處理IRE處理組、pGenesil-N+IRE組和pGenesil-E6+IRE組后，pGenesil-N組、pGenesil-E6組按照Lipofecter脂質體轉染試劑盒說明書進行質粒轉染。

1.5倒置熒光顯微鏡觀察SiHa細胞中GFP表達電處理后24 h，用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態學、GFP表達情況。隨機選取5個高倍視野,分別計數細胞總數和發綠色熒光的細胞數，重復計數3次。表達效率=發綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.6RT-PCR法檢測HPV16 E6 mRNA的表達TRIzol試劑盒提取各組細胞總mRNA，RT-PCR試劑盒檢測各組細胞HPV16 E6 mRNA表達量。靶基因上游引物:5′-GAGCGACCCAGAAAGTTACCA-3′，下游引物：5′-AAATCCCGAAAAGCAAAGTCA -3′；GAPDH基 因 上 游 引 物:5′-AGGCCGAGAATGGGAAGCTTGTC-3′，下游引物:5′-CCCGGCATCGAAGGTGGAAGAG-3′。反應條件:95℃預變性5 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、90 s，30個循環，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后凝膠成像儀顯影。按照相對定量的方法，利用HPV16 E6 mRNA基因與內參GAPDH的定量結果計算2-Δ ΔCt值，HPV16 E6 mRNA表達抑制率=(1-HPV16 E6 mRNA基因相對表達水平)×100%。

1.7Western blotting法檢測各組細胞HPV16 E6、P53及PCNA的表達采用總蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，15%SDS-PAGE凝膠電泳，常規濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜[E6(1∶200)，P53(1∶500)，PCNA (1∶500)，GAPDH(1∶3 000)]，HRP標記的羊抗兔( 1∶5 000，P53/PCNA/GAPDH)、羊抗鼠(1∶5 000，E6)二抗常溫孵育1 h，ECL發光顯色,進行E6、P53和PCNA與GAPDH相對強度的比值分析。

1.8CCK-8法測定細胞增殖能力各組細胞處理后，離心、完全培養基重懸，調整細胞密度為8×104mL-1，每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板。背景組不接種細胞只加入相應體積的培養基，每組設置5個復孔，培養24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，細胞孵箱中孵育2 h，酶標儀測定各孔的吸光度(A)值，波長選擇450 nm，計算各處理組中的相對細胞數。實驗重復3次。

2　結　果

2.1HPV16基因shRNA重組質粒測序鑒定重組質粒單酶切后，在DL 2000 DNA marker凝膠電泳出現200 bp左右(引物+目的片段)的片段，證明人HPV16 E6 shRNA基因已成功插入到載體中；測序結果顯示重組質粒的目的序列與設計的寡核苷酸序列一致。見圖1。

2.2倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達效率IRE轉染后24 h，SiHa細胞在熒光顯微鏡下發出綠色熒光(圖2，見插頁一)。pGenesil-N+IRE組與pGenesil-E6+IRE組GFP表達效率比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明IRE可以發揮基因轉染作用，促進外源基因進入細胞內部。由于pGenesil-1載體上含有neo基因，使用G418篩選IRE處理后的細胞，傳代5次以后，使pGenesil-N+IRE組IRE聯合陽性質粒與pGenesil-E6+IRE組GFP陽性細胞數比例升高，與pGenesil-N組和pGenesil-E6組比較，GFP表達效率差異無統計學意義(P>0.05)。

M:DL 2000 DNA marker； Lane 1： pGenesil-E6; Lane 2:pGenesil-N； Lane 3:pGenesil-1 blank vector.

圖1重組質粒單酶切鑒定結果

Fig.1Single enzyme digestion results of recombinant plasmid

2.3IRE處理質粒后SiHa細胞中HPV16 E6 mRNA及相關蛋白表達水平RT-PCR法檢測結果：與正常對照組和IRE組比較，pGenesil-E6組及pGenesil-E6+IRE組HPV16 E6 mRNA表達水平均降低(P<0.05)，以pGenesil-E6+IRE組更明顯，E6 mRNA降低(63.23±8.17)%(圖3A和B)。Western blotting法檢測結果：E6蛋白表達趨勢與PCR結果一致，與IRE處理組比較，pGenesil-E6+IRE組E6蛋白表達水平[(51.06±6.32)%]降低(P<0.05)；同時P53蛋白水平[(246.27±13.18)%]升高，PCNA表達水平[(63.26±7.17)%]降低(圖4A和B)。

2.4CCK-8實驗測定各組細胞增殖情況CCK-8實驗檢測結果顯示：96 h時pGenesil-E6組細胞增殖活性顯著低于對照組(P<0.05)，pGenesil-N+IRE組細胞增殖活性明顯低于IRE組(P<0.05)，pGenesil-E6+IRE組細胞增殖活性明顯低于pGenesil-N +IRE組(P<0.05)。各組SiHa細胞增殖活性從48 h開始出現升高，pGenesil-E6組細胞增殖活性低于對照組(P<0.05)，pGenesil-E6+IRE組細胞增殖活性低于pGenesil-N +IRE組(P<0.05)。 見表1。

A:Electrophoregram;Lane 1:NC group;Lane 2:IRE group;Lane 3:pGenesil-N group;Lane 4:pGenesil-E6 group;Lane 5:pGenesil-E6 group;Lane 6:pGenesil-E6+IRE.B:E6 mRNA semi-quantitative analysis;a:P<0.05vspGenesil-N group; b:P<0.05vspGenesil-N +IRE group; c:P<0.05vspGenesil-E6 group.

圖3IRE處理后SiHa細胞中HPV16 E6 mRNA表達

Fig.3Expressions of HPV16 E6 mRNA in SiHa cells after treated with IRE detected by RT-PCR

A:Electrophoregram;Lane 1:NC group;Lane 2:IRE group;Lane 3:pGenesil-N group;Lane 4:pGenesil-E6 group;Lane 5:pGenesil-E6 group;Lane 6:pGenesil-E6+IRE.B:E6 mRNA semi-quantitative analysis;a:P<0.05vspGenesil-N group; b:P<0.05vspGenesil-N +IRE group; c:P<0.05vspGenesil-E6 group.

圖4Western blotting法檢測IRE處理后SiHa細胞E6及相關蛋白表達

Fig.4Expressions of E6 mRNA and related proteins in SiHa cells after treated with IRE detected by Western blotting method

表1　CCK-8實驗檢測各組SiHa細胞增殖活性

*P<0.05，P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with IRE group；#P<0.05 compared with pGenesil-N +IRE group.

3　討　論

通過調整PEF的相關物理參數(電壓、脈寬、頻率和脈沖個數)可以觀察到復雜的生物學效應，這主要與位于電場內的細胞或亞細胞結構的變化有關[9]。PEF在生命科學領域內的早期應用，均基于PEF的可逆性電穿孔RE效應，撤去外加電場后，細胞膜表面的孔洞自然閉合，不影響細胞的存活[10]。在孔洞閉合之前，細胞周圍的大分子(DNA、化療藥物和碘化丙啶PI等)可以通過該孔洞進入細胞，這就是基因電轉染、EGT或ECT。在此過程中，PEF的主要作用是開放細胞膜、形成孔洞，但必須要保證細胞的存活率，因此，一般外加電場的場強較低即閾值場強為<667 V·cm-1，這是發生IRE損傷的理論閾值[3]，大于此閾值，細胞將發生不可逆性電穿孔，導致細胞死亡。

本課題組前期研究已證實HeLa細胞在參數為“脈寬100 μs,頻率1 Hz,脈沖8個”的PEF作用下，發生凋亡的閾值場強為1 250～1 500 V·cm-1,發生不可逆性電穿孔而早期壞死的閾值場強為1 750 V·cm-1[11],而且亞致死劑量PEF對HeLa細胞增殖無明顯影響[12]。因此，本研究保持其他參數同前(脈寬100 μs，頻率1 Hz，脈沖8個)，而采用了較高場強2 000 V·cm-1(確保發生IRE)，以驗證IRE介導干擾質粒進入細胞的可行性，以及二者對宮頸癌SiHa細胞增殖的影響。

本研究成功構建了GFP標記的靶向HPV16型病毒E6基因的質粒pGenesil-E6，采用治療劑量的PEF處理SiHa細胞后24 h，在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，表明治療劑量PEF可介導質粒進入腫瘤細胞。本研究進一步顯示：雖然在參數為電壓800 V(場強2 000 V·cm-1)、脈寬100 μs、頻率1 Hz、脈沖個數10個時，細胞增殖受到抑制，但與正常對照比較差異無統計學意義；而IRE轉染pGenesil-E6質粒后，E6蛋白表達水平降低，P53蛋白表達水平增加，與細胞增殖相關的PCNA表達降低，細胞增殖能力與脂質體轉染pGenesil-E6比較差異有統計學意義。上述結果表明：靶向HPV16 E6基因的shRNA發揮了基因沉默的作用，E6蛋白可能參與細胞增殖的調節； IRE與靶基因轉染或有協同作用，使得pGenesil-E6+IRE發揮了更強的抑制增殖作用。本文作者猜測這可能是二者共同作用影響了PEF的“劑量效應窗口”，或者在IRE與shRNA干擾質粒之間存在某種協同作用，其具體機制有待進一步研究。

雖然IRE已成功應用于多種實體腫瘤(肝、腎、胰腺和前列腺等)的實驗性治療，且展現了良好的應用前景[2]，但是由于PEF自然屬性，IRE損傷區域存在較大異質性[13](不同組織或者個體存在電導性差異)、治療區域偏小(單次治療體積≤1 cm3)[13-14]。Qin等[15]研究發現：未完全消融的腫瘤組織有較高的復發風險。本研究所驗證的“治療劑量IRE也可發揮基因轉染作用”的實驗基礎，有望克服上述單用IRE存在的問題，因此這將為嘗試聯合IRE與干擾質粒對宮頸癌的物理治療奠定理論基礎。

[1]Yao C,Guo F,Li C,et al.Gene transfer and drug delivery with electric pulse generators[J].Curr Drug Metab,2013,14(3):319-323.

[2]Silk M,Tahour D,Srimathveeravalli G,et al.The state of irreversible electroporation in interventional oncology[J].Semin intervent Radiol,2014,31(2):111-117.

[3]Rubinsky B,Onik G,Mikus P.Irreversible electroporation:a new ablation modality -clinical implications[J].Technol Cancer Res Treat,2007,6(1):37-48.

[4]Au JT,Mittra A,Song TJ,et al.Irreversible electroporation facilitates gene transfer of a GM-CSF plasmid with a local and systemic response[J].Surgery,2013,154(3):496-503.

[5]Steenbergen RD,Snijders PJ,Heideman DA,et al.Clinical implications of (epi)genetic changes in HPV-induced cervical precancerous lesions[J].Nat Rev Cancer,2014,14(6):395-405.

[6]Hacein-Bey-Abina S,Von Kalle C,Schmidt M,et al.A serious adverse event after successful gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency[J].N Engl J Med,2003,348(3):255-256.

[7]Guo H,Hao R,Wei Y,et al.Optimization of electrotransfection conditions of mammalian cells with different biological features[J].J Membrane Biol,2012,245(12):789-795.

[8]Butz K,Ristriani T,Hengstermann A,et al.siRNA targeting of the viral E6 oncogene efficiently kills human papillomavirus-positive cancer cells[J].Oncogene,2003,22(38):5938-5945.

[9]Jiang C,Davalos R,Bischof JC.A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy[J].IEEE Trans Biomed Eng,2015,62(1):4-20.

[10]Yarmush ML,Golberg A,Ser?a G,et al.Electroporation-based technologies for medicine:principles,applications,and challenges[J].Annu Rev Biomed Eng,2014,16(1):295-320.

[11]周瑋,熊正愛,劉穎,等.不可逆性電穿孔致HeLa細胞凋亡與壞死的作用研究[J].第三軍醫大學學報,2010,32(18):1941-1944.

[12]周瑋,熊正愛,劉穎,等.亞致死劑量脈沖電場對HeLa細胞惡性生物學行為的影響[J].第三軍醫大學學報,2012,34(16):1604-1607.

[13]Guo Y,Zhang Y,Klein R,et al.Irreversible electroporation therapy in the liver:longitudinal efficacy studies in a rat model of hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2010,70(4):1555-1563.

[14]Ellis TL,Garcia PA,Rossmeisl JH Jr,et al.Nonthermal irreversible electroporation for intracranial surgical applications[J].J Neurosurg,2011,114(3):681-688.

[15]Qin Z,Jiang J,Long G,et al.Irreversible electroporation:an in vivo study with dorsal skin fold chamber[J].Ann Biomed Eng,2013,41(3):619-629.

Influence of irreversible electroporation mediated HPV16 E6 shRNA interference plasmid in proliferation of cervical cancer SiHa cells

WANG Zhiliang1，YU Tenghua2，QIN Qin1，WU Yutong1，ZHANG Wenqian1，HUA Yuanyuan1，XIONG Zhengai1，ZHOU Wei3

(1.Department of Gynecology and Obstetrics,Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University,Chongqing 400010,China; 2.Department of Endocrine and Breast Surgery,First Affiliated Hospital,Chongqing Medical University，Chongqing 400016,China; 3.Department of Obstetrics,Chongqing Health Center for Women and Children,Chongqing 400013,China)

Objective To explore the feasibility of using irreversible electroporation(IRE) mediating HPV16 E6 shRNA into cervical cancer cell line SiHa，and to clarify the influence of their co-effect on the proliferation of SiHa cells and its mechanism.MethodsA HPV16 E6 gene specific interference sequence was inserted in pGenesil-1 to build a interference vector.10 pulses of IRE with 800 V,100 μs， and 1 Hz were applied to the suspension of SiHa cells and vectors.According to the treatment factors,control group,IRE group,pGenesil-N group,pGenesil-N+IRE group,pGenesil-E6 group and pGenesil-E6+IRE group were set up.The expression of green fluorescent protein (GFP) and transfection efficiency were confirmed by inverted fluorescence microscope 24 h after the vector was transfected by IRE,and the expression efficancy of GFP was calculated.The expression levels of E6 mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotting method which was also applied to detect the expressions of P53 and PCNA.The proliferative activity of SiHa cells was determined by CCK-8 assay． ResultsEnzyme digestion and DNA sequencing verified that the vectors were correctly constructed． GFP was seen under inverted fluorescence microscope 24 h after IRE transfection.Compared with IRE group,the expression levels of E6 mRNA and protein were decreased detected by RT-PCR and Western blotting method after the vectors were treated with IRE,the P53 protein expression level was increased(P<0.05),and the PCNA expression level was decreased(P<0.05). The CCK-8 assay results showed the proliferative activity of SiHa cells in pGenesil-E6+IRE group was decreased more obviously than that in pGenesil E6 group (P<0.05).ConclusionIRE can play the role of gene transfection of mediating HPV16 E6 shRNA into SiHa cells,and their co-effect can significantly inhibit the proliferation of SiHa cells.

electroporation；interference plasmid；uterine cervical neoplasms; cell proliferation

1671-587Ⅹ(2015)06-1107-06

10.13481/j.1671-587x.20150602

2015-04-03

國家自然科學基金資助課題(81201745，81301928)；重慶市衛生局醫學科研項目資助課題(2011-2-155)

王智亮(1987-)，男，陜西省漢中市人，在讀醫學博士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。

周瑋，副主任醫師(Tel：023-60333346，E-mail:dr.zhouwei@163.com)

R737.33

A