外周血染色體制備方法的探討

莊建龍，王元白，莊倩梅

（泉州市婦幼保健院·兒童醫院產前診斷中心，福建泉州362000）

染色體核型分析對人類遺傳病的研究和診斷有著非常重要的意義［1］，而其中染色體G 顯帶長度是診斷染色體結構異常的關鍵［2］。秋水仙素使處于增殖周期中的分裂細胞停止在中期。秋水仙素的加入量和加入時間成為獲得中期有絲分裂細胞的關鍵［3］。通過改變秋水仙素處理時間及用量等幾個關鍵步驟，成功地改良了外周血染色體的質量，不僅在染色體長度、分散度及帶型上得到了很大程度的改善，而且也大大地縮短了制備時間，節省了人力資源。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2014年7月于本院進行了產前診斷中染色體檢查的1 170例患者。

1.2 儀器與試劑 細胞培養箱為美國SHEL LAB產品，淋巴細胞培養液6mL為青島萊佛生物工程研究所產品，秋水仙素100μg／μL，胰酶為美國Gibco公司產品，0.075mol／L 氯化鉀低滲液，新鮮配制的固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1），pH7.4和pH6.8磷酸鹽緩沖液，吉姆薩染液購自青島萊佛生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 接種 用肝素濕潤注射器無菌操作抽取2 mL 靜脈血，取外周血淋巴細胞培養液溶解，碘伏消毒培養瓶蓋后，在酒精燈火焰旁加入0.5mL血標本（與本室常規制備一致）。

1.3.2 培養 將接種后標本置37 ℃培養箱中培養68～72h（與本室常規制備一致）。

1.3.3 收獲 收獲前15 min加入100μg／μL 秋水仙素50 μL，將培養的細胞移入10 mL 刻度離心管中，2 000r／min離心10min（本室常規操作為收獲細胞前1h加入100μg／μL秋水仙素17μL，2 000r／min離心10min。

1.3.4 低滲 離心l0min棄上清液后加入8mL 0.075mol／L的KCl低滲液，吹打均勻后置于37℃水浴箱15min，取出離心管加入新鮮配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）0.5mL［4］預固定10min，以2 000r／min離心10min（本室常規操作為低滲30min，加入2mL固定液預固定，2 000r／min離心10min）。

1.3.5 固定 離心后棄去上清，加入新鮮配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）8mL，混勻后室溫放置30min，2 000r／min離心10min后，重復以上步驟進行再固定。最后根據沉淀量多少制備出濃度大致一致的混懸液（0.5～1mL），本室常規操作為2 000r／min離心10min。

1.3.6 推片 吸取2～4滴細胞懸液滴于潔凈載玻片上，每人制2～3片，吸取30μL左右懸液吹散，酒精燈過火后將制備的染色體標本片置鼓風干燥箱內70℃3h進行老化，取出后自然冷卻至室溫（本室常規操作為60 ℃3h）。染色顯帶方法參考《人類染色體方法學手冊》［5］。

1.4 分散效果判斷 在20個計數分裂相中計數：（1）不合格標本判斷標準為染色體相互纏繞或重疊小于等于2條的核型小于或等于50%（10／20）；（2）合格標本的判斷標準為染色體相互纏繞或重疊小于等于2 條的核型為50%～75%［（10～15）／20］；（3）最佳標本的判斷標準為染色體相互纏繞或重疊小于等于2條的核型大于或等于75%（15／20）。

1.5 帶型效果判斷 在20個計數分裂相中，不合格標本：染色體長度較短，染色體帶紋不清，但可以辨認出2 號、4 號、6號、13號、17號、20號及22 號染色體特征性帶型；合格標本：可以清楚地辨認2號、4號、6號、13號、17號、20號及22號染色體特征性帶紋，其中染色體可分析且長度較理想的核型5%～25%［（1～5）／20］；最佳標本：在合格標本上，染色體可分析且長度理想的核型大于或等于25%（5／20）。

1.6 統計學處理 隨機抽取改良前和改良后標本各200份，進行分散效果和帶型效果判斷，用SPSS18.0軟件進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與本室常規處理（圖1A、1B）相比，改良后的外周血染色體分散度好，分裂相多，長度更長，帶型清晰，染色穩定易于控制，非常適合批量處理（見圖1C、1D）。改良后染色體長度更長，分散度更好，顯示帶型增多，更有利發現異常染色體，減少了漏診率，值得推廣應用。經過統計學分析，改良后與改良前的分散度及帶型的合格率與最佳率差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1、2。

圖1 改良前后的染色體帶型圖

表1 改良前后染色體分散效果比較

表2 改良前后染色體顯帶效果比較

3 討 論

通過對秋水仙素，低滲，預固定和固定等步驟的改良，制備出的染色體標本相比本室常規制備的染色體標本不僅有更好分散度，染色體長度更長，帶型顯示更多，而且制備更穩定。

首先，秋水仙素為細胞培養中使用的紡錘體阻斷劑，它使正在分裂的細胞停留在分裂中期，以獲得大量中期分裂相供分析研究所用。在血細胞培養時，秋水仙素加入的劑量、濃度及處理時間與中期分裂相的多少和染色體長短有密切的關系［6－7］。秋水仙素加入量過多，染色體太短，加入量太少，染色體瘦長或很少中期分裂相。因此，加入較高濃度短時間的處理，將本室常規制備時秋水仙素的終濃度由0.28μg／μL，調整至0.83μg／μL，處理時間由1h縮短至15min，不僅提高了效率，而且獲得了較多的分裂相，更長的染色體，顯示更多帶型，有利于異常染色體的檢出。有文獻報道加入100μg／μL 秋水仙素100μL［6］，筆者認為其染色體長度及帶型未達到最佳，可能是秋水仙素用量過多導致染色體收縮。改良后的染色體制備方法，加入50μL 秋水仙素，能夠得到滿意的染色體長度及帶型。

其次，低滲技術是染色體培養中的光鍵環節，低滲時間長短關系到分散的好壞。處理時間多長，將導致細胞膜過早破裂，造成分裂中期細胞丟失；處理時間過短，細胞膨脹不足，則染色體分散不佳。低滲處理適當，所得染色體分散度好，輪廓清楚，可染色強，在顯帶染色時能很好地顯示帶型特征［8］。因此，筆者將本室常規制備低滲時間30min改良為15min，獲得染色體的分散度好，可染色性強，帶型顯示穩定，同時也提高了工作效率。

再次，預固定也是染色體制備的一個重要影響因素，桂俊豪等［9］的研究表明，當預固定液劑量占總體積的1.25%、2.50%或3.75%時，染色體分散質量較好，可用核型多；預固定液比例大于或等于6.25%可導致細胞間相互粘連，且染色體間相互積聚的傾向更為明顯。因此，筆者將原來的預固定液劑量由2mL改良為500μL，約占總體積的3.75%，處理后發現較少的預固定液能夠獲得更加干凈的沉淀和良好的分散度，經過統計學分析表明，改良后染色體的分散度與改良前有明顯差異。

固定應徹底，吹打不要太用力，以免細胞破裂，染色體丟失。若固定不徹底，染色體分散不佳，可重復固定或延長固定時間。

最后，經過大量的實踐證明，改良后的方法在各個方面都優于常規操作方法。該法不僅在染色體的質量上有了大大的提升，而且提高了工作效率，值得廣泛的推廣。

［1］周煥庚，夏家輝，張思仲.人類染色體［M］.北京：科學出版社，1987：48－63.

［2］張鳳芹，丁紅煒，石慶芳，等.關于外周血染色體制備方法的改進［J］.中國誤診學雜志，2008，8（5）：1198.

［3］陳秀云.外周血染色體制作方法改進［J］.現代預防醫學，2006，33（5）：796－799.

［4］斯佩克特，戈德曼，萊因萬德.生物學指南［M］.黃培堂，譯.北京：科學出版社，2002：1067－1068.

［5］高錦聲，鄭斯莢，陳嘉政，等.人類染色體方法學手冊：修訂本［M］.南京：江蘇省醫學情報研究所，1981.

［6］謝志威，張晶，李衛凱.外周血染色體制備改良方法的應用［J］.國際檢驗醫學雜志，2013，34（1）：82－83.

［7］張穎珍.人體外周血染色體G 顯帶制備時的影響因素及補救措施［J］.中國優生優育，2010，16（5）：265－267.

［8］慕明濤，霍滿鵬，蒲力群，等.人外周血染色體標本制備失敗的影響因素分析［J］.延安大學學報：醫學科學版，2007，5（4）：3.

［9］桂俊豪，黃國香，王錚，等.Carnoy′s預固定劑量對中期染色體分散度的影響［J］.國際遺傳學雜志，2006，29（6）：416－419.