膽紅素對小膠質細胞BV－2表面分子Toll樣受體4mRNA 表達的影響＊

關小勇，李雪麗，陳華干，高 干

（柳州市婦幼保健院檢驗科，廣西柳州545001）

新生兒高膽紅素血癥以非結合膽紅素為主，可引起膽紅素腦病，遺留神經系統后遺癥［1］。小膠質細胞是神經膠質細胞的一種，約占全部膠質細胞的5%，起到類似巨噬細胞的作用，是中樞神經系統中的第一道，也是最主要的一道免疫防線［2］。Toll樣受體（TLRs）是機體重要的天然免疫受體分子之一，主要表達于單核巨噬細胞，可識別革蘭陰性細菌細胞壁成分脂多糖（LPS），啟動信號傳導，介導天然免疫［3］。有研究對新生兒黃疸的原因進行調查發現，母嬰同室前引起新生兒高膽紅素血癥的主要原因是感染［4］。新生兒感染性疾病如肺炎、臍炎、眼結膜炎、膿皰疹等，其內毒素即LPS，以及產生的細胞因子可以抑制肝臟功能，使紅細胞破壞產生溶血，加重新生兒黃疸的程度［4］。因此，本研究擬通過觀察經膽紅素孵育后小膠質細胞系在LPS刺激后BV－2表面分子TLR4 mRNA 的表達情況，探討膽紅素對小膠質細胞免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠小膠質細胞系購自上海橋社生物科技公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI1640基礎培養基為Gibco公司產品，膽紅素為Fluka公司生產脂溶性的非結合膽紅素（UBC），清蛋白為Sigma公司產品，RNAisoPlus總RNA 提取試劑盒、SYBR Green Real－time PCR試劑盒為TaKara公司產品，逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，引物合成由Invitrogen公司完成。其余所用試劑為國產分析純。

1.2 主要儀器 低溫高速離心機為美國Beckman公司生產的AvantiTM30，CO2恒溫培養箱為Thermo公司產品，PCR 分析儀為美國ABI生產，型號為Veriti96。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 實驗用小鼠小膠質細胞株BV－2為貼壁細胞，復蘇BV－2細胞，置于RPMI－1640培養液（含10%胎牛血清，100U／mL青霉素和鏈霉素）中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，根據細胞代謝情況，1～2d換液，至指數生長期收集細胞懸液，細胞計數板計算細胞數，以RPMI－1640培養液調整成1×105／mL細胞懸液備用。

1.3.2 實驗分組 制備好的細胞懸液接種于24孔塑料培養板，分為6個組。空白對照組和LPS對照組只加調整好的細胞液使反應體系為1mL；4個不同濃度的膽紅素干預組加入UBC，調整其反應體系中UBC 的濃度分別為25、50、100、200 μmol／L，整個反應體系為1mL。6個組避光孵育1h，棄掉上清液，加入LPS溶液（1 000μg／mL），其中空白對照組只加入完全培養基2mL，其余組均加入1.98mL 培養基和0.02mL LPS溶液，反應體系為2mL，LPS終濃度為10μg／mL，混勻。在37 ℃、5%CO2條件下培養24h。

1.3.3 細胞總RNA 的提取 按照RNAisoPlus總RNA 提取試劑盒的操作說明進行［5］。

1.3.4 逆轉錄 在冰上分別加入1μg的RNA 模板和1μL oligo（dT）18primer，用水補至12μL，65 ℃，5min。于冰上冷卻后，分別加入4μL 5XReaction Buffer、1μL RNase Inhibitor、2mL 10mmol／L dNTP Mix和1μL M－MuLV Reverse Transcriptase，輕輕混勻稍稍離心后，置于PCR 儀中42 ℃60min，然后70 ℃5min終止反應。

1.3.5 Real－time PCR 在25μL反應體系中，分別加入12.5 μL SYBR Green PCR Mix、10.5μL滅菌水、0.5μL P1、0.5μL P2和1μL cDNA 模板，參照文獻［5］加入TLR4引物（506bp）上游：5′－TGG ATA CCG TTT CCT TAT AAG－3′，下 游：5′－GAA ATG GAG GCA CCC CTT C－3′，內 參GAPDH（220 bp）。混勻并稍稍離心后，置于Rotor－Gene 3000 熒光定量PCR 儀中，按如下 條 件 進 行Real－time PCR：94 ℃，10 min，40個循環（94 ℃，30s；57 ℃，30s；72 ℃，60s）。擴增產物用Rotor－Gene6000software1.7系統分析結果。

1.4 統計學處理 各項實驗重復3 次，所得數據采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理。兩組間比較使用t檢驗，多個樣本間的兩兩比較使用One－way ANOVA，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

圖1 的結果顯示，LPS 對照組與空白對照組比較TLR4 mRNA 的表達雖然略低，但兩者差異無統計學意義（P＞0.05）；而兩者與4個不同濃度的膽紅素干預組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且膽紅素濃度越高差異就越顯著。4個不同濃度的膽紅素干預組兩兩比較小膠質細胞系BV－2表面分子TLR4mRNA 的表達隨著膽紅素濃度的增高呈逐漸降低趨勢，可見膽紅素可對小膠質細胞系BV－2表面分子TLR4 mRNA 的表達起抑制作用，且抑制作用的強弱與膽紅素的濃度呈正相關。

圖1 不同濃度膽紅素作用后TLR4mRNA 的表達情況

3 討 論

中樞神經系統是機體免疫機制的特殊區域，缺乏淋巴系統，并有血腦屏障的保護。小膠質細胞是腦內的駐留型巨噬細胞。一些神經病理學研究表明激活的小膠質細胞在神經退化類疾病的發病機制中起著重要作用。許多生理或病理因素如血壓的突然變化、免疫刺激和外傷、非結合膽紅素的侵入等均可導致血腦屏障破壞、通透性升高，使血循環中的物質滲入引起中樞神經系統的病理性改變［6］。TLR4是模式識別受體的一個重要成員，隨著研究的深入，發現TLR4在促進細胞因子的合成與釋放，引發炎癥反應，促進免疫細胞的成熟和分化，以及抗感染、調節免疫應答等方面起到重要的作用［7］。

新生兒黃疸多為生理性黃疸，呈良性經過，如病理性黃疸膽紅素濃度過高會產生細胞毒作用，早產兒由于血腦屏障及免疫功能不全更易發生高膽紅素血癥及膽紅素腦病［1］。膽紅素不僅有神經毒性，對免疫系統亦有明顯的抑制作用［8］。本研究結果顯示，沒加入UBC 孵育的LPS 對照組與空白對照組比較，LPS對照組TLR4mRNA 的表達雖然略低，但兩者沒有顯著差異。而小鼠小膠質BV－2細胞在不同濃度的膽紅素孵育后再經LPS刺激，TLR4的表達明顯受到抑制，且濃度越高抑制作用就越明顯，可見在感染和高膽紅素的共同作用下，中樞神經系統的免疫功可能會受到更大的抑制，從而導致黃疸患兒的免疫力低下更易并發感染。膿毒癥、嚴重的高膽紅素血癥、細菌感染可以看作核黃疸的高危因素［4］。膽紅素在LPS協同下抑制TLR4表達的機制可能是：膽紅素首先損傷小鼠小膠質細胞細胞膜，致TLR4受體結構破壞、數量減少和功能喪失，識別LPS的能力下降［9］；接著膽紅素破壞線粒體，使細胞氧化磷酸化過程受阻，從而干擾能量代謝，氨基酸合成蛋白質減少［10］；然后膽紅素破壞細胞核，最終影響TLR4 的轉錄與合成。

綜上所述，高濃度膽紅素對小膠質細胞BV－2 表面分子TLR4的表達有明顯抑制作用，在臨床上對嚴重高膽紅素血癥患兒應早期進行干預，改善患兒的免疫功能，并發感染患兒及早產兒由于血腦屏障破壞、通透性升高更易發生膽紅素毒性損傷，治療更應積極。

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