高血脂高膽紅素對IE－HPLC法檢測糖化血紅蛋白干擾的評價＊

蕭金麗，張秀明，徐勝男，索明環，徐全中，陳亞瓊，吳劍楊，李 曼，闞麗娟，溫冬梅

（中山大學附屬中山醫院檢驗醫學中心，廣東中山528403）

2010年美國糖尿病學會（ADA）發布的糖尿病治療準則中，正式將糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%作為糖尿病診斷標準，5.7%～6.2%為糖尿病高危人群，≥9.5%為糖尿病并發癥的獨立危險因素。HbA1c測定作為糖尿病流行病學和監測糖尿病長期治療效果的重要指標，近年來備受關注［1－2］。因此，在充分肯定HbA1c診斷糖尿病的優越性的同時，客觀地闡明HbA1c在實際臨床應用中的缺陷同樣很有必要，這對于HbA1c更好地應用于臨床具有重要的意義［3］。本研究參考美國國家糖化血紅蛋白標準化計劃（NGSP）認證的Ⅰ級實驗室的標準，以美國Primus Ultra2糖化血紅蛋白分析儀硼酸鹽親和層析高效液相色譜法（AC－HPLC）為對照系統［4－6］，與美 國Bio－Rad VariantⅡ糖化血紅蛋白分析儀離子交換高效液相色譜法（IE－HPLC）HbA1c檢測結果進行比較分析，探討高血脂和高膽紅素對IE－HPLC的影響。

1 資料與方法

1.1 標本來源 全血標本來源于2012年5月至2013年10月中山市人民醫院的住院、門診患者或健康體檢者。收集當天新鮮EDTA－K2抗凝全血標本，－70 ℃保存。將收集的新鮮EDTA－K2抗凝全血標本分成4組：對照組（HbA1c＜6.2%）、糖尿病組（HbA1c≥6.2%）、高血脂組（TG 3～20mmol／L）、高膽紅素組（TBIL 21～549μmol／L）［7］。對照組標本來自本院康體保健中心體檢的40例健康成年人，無渾濁、無血紅蛋白變異體、無高膽紅素、無高血脂。糖尿病組標本來源于本院確診的2型糖尿病患者，無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，無高膽紅素、高血脂，同時排除尿毒癥和慢性腎衰的患者，共40例；糖尿病的診斷標準符合世界衛生組織（WHO）1999年診斷標準。高膽紅素組標本來自本院住院或門診患者，TBIL≥21μmol／L；無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，患者無高血脂、尿毒癥，共40例。高血脂組來自本院住院、門診患者或健康體檢者，TG≥3mmol／L；無貧血、溶血，無血紅蛋白變異體，無高膽紅素，患者無尿毒癥，共40例。各組標本來源患者的一般資料見表1（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

1.2 儀器與試劑 美國Primus Ultra2糖化血紅蛋白分析儀采用硼酸鹽AC－HPLC 檢測，美國Bio－Rad VariantⅡ糖化血紅蛋白分析儀采用IE－HPLC 檢測進行比較分析，采用各檢測儀器配套的試劑、校準品、質控品和耗材。

1.3 方法

1.3.1 儀器校準 采用新鮮全血校準的方法，一致性測定數據見文獻［8］。參照NGSP能力驗證方法，檢測健康對照組40份標本，每天檢測8份，連續測定5d。

1.3.2 實驗方法 參照CLSI EP9－A 文件［9］，實現2個檢測系統結果的一致性后，參照相關文獻［5－7］，所有檢測HbA1c的方法中以硼酸鹽AC－HPLC 最不受干擾，故以Primus Ultra2作為對照系統，Bio－Rad VariantⅡ為實驗系統，分別檢測糖尿病組、高膽紅素組和高血脂組標本，每天檢測8份，連續測定5d。

1.4 統計學處理

1.4.1 使用Microsoft Excel軟件進行統計學分析。參照NGSPⅠ級實驗室能力驗證可接受標準［10］，對兩種檢測系統的實驗數據進行直線回歸分析和偏差（%）分析，實驗系統與對照系統差值的95%置信區間（95%CI）差異在參考系統的±0.70范圍內以及實驗系統與對照系統偏差小于6%作為檢測結果可比的2項可接受標準。

1.4.2 使用SPSS17.0軟件進行統計學分析。檢測結果的組間比較采用配對t檢驗，采用直線回歸相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 對照組的比對 經新鮮全血校準后，對2臺儀器進行對照組標本的比對試驗。以Primus Ultra2 的測定值為Y，Bio－Rad Variant Ⅱ的測定值為X，直線回歸方程為Y ＝0.959 4 X＋0.205 3，r＝0.993，差 異 無 統 計 學 意 義（P ＝0.795）；95%CI：－0.20～0.15，符合在±0.70范圍內的標準；偏差（%）為－0.20%～0.30%符合偏差小于6%的標準。見圖1、2（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

2.2 異常組的比對 用2臺儀器分別測定糖尿病組、高膽紅素組和高血脂組3組標本并作直線回歸分析。3組數據的相關系數均大于0.95說明結果分布范圍符合要求。當HbA1c≤18.7%時IE－HPLC 檢測HbA1c相關系數r＝0.993，95%CI為－0.71～0.89，偏差（%）為－5.8%～6.8%，差異無統計學意義（P ＝0.198）。當HbA1c＜16.3%時IE－HPLC 檢 測HbA1c相關系數r＝0.997，95%CI 為－0.31～0.67，偏差（%）為－5.8%～4.3%，差異有統計學意義（P＝0.000），無明顯干擾；當HbA1c為16.3%～18.7%時結果出現正偏倚。當TG≤20.78mmol／L時IE－HPLC檢測HbA1c結果相關系數r＝0.995；95%CI 為－0.26～0.50；偏差（%）為－5.5%～5.8%；差異有統計學意義（P＝0.000），結果無明顯干擾。當TBIL≤549.3μmol／L時，用IE－HPLC檢測HbA1c，相關系數r＝0.990；95%CI 為－0.08～0.63；偏差（%）為－14%～4.1%；差異有統計學意義（P＝0.000）。當TBIL≤342.1 μmol／L IE－HPLC檢測HbA1c，相關系數r＝0.994；95%CI為－0.09～0.50；偏差（%）為－5.5%～4.1%；結果無明顯干擾；當TBIL為380.7～549.3μmol／L 時結果出現負偏倚。見表2及圖3～6（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

表2 Bio－Rad VariantⅡ與Primus Ultra2兩系統檢測HbA1c的直線回歸分析和偏差分析

3 討 論

2013年國際糖尿病聯盟（IDF）公布，中國糖尿病的患病人數為9 840萬，居全球首位，同時根據IDF 估計，到2035年中國的糖尿病患病人數將達到1.43 億。HbA1c作為首選診斷指標，與FBG 和OGTT 相比，檢測便捷、可任意時間采血，準確性、可重復性高，是一個宏觀的控制指標。在過去的20多年中，HbA1c檢測主要用于糖尿病控制、治療效果評價以及并發癥風險評估，從“評估指標”發展到“診斷指標”，體現出HbA1c在臨床應用中的優勢和價值［4］。但目前我國HbA1c的檢測結果一致性現狀與臨床要求尚存在差距。國內各臨床實驗室分析儀器種類較多，采用的試劑來源較多，檢測性能、試劑規格、分析參數亦各不相同。這些原因使不同實驗室間的檢測結果存在差異，不具有可比性，給臨床應用帶來不便［11］。多種因素可影響HbA1c檢測，其中疾病狀態，如高脂血癥、高膽紅素血癥都會干擾HbA1c檢測［4］。并且臨床醫生在解讀HbA1c結果時，HbA1c變化值超過0.5%時醫生就有可能改變治療方案，不準確的結果會造成對患者病情的誤判或延誤治療。本研究旨在分析高血脂和高膽紅素對HbA1c的檢測造成的影響。

IE－HPLC是根據HbA1c與HbA0的等電點不同進行分離。葡萄糖與Hb的β鏈N 未端Val連接降低了等電點，導致糖化Hb帶的正電荷比未糖化Hb的少，與樹脂的附著力小，可以分別用不同離子濃度的緩沖液在不同的時間將Hb從陽離子交換柱中洗脫下來，再根據每個峰值下的面積來計算HbA1c占總Hb的比例［12］。常規的離子交換HPLC 法經過多年技術上的改進，檢測精密度、分辨率及抵抗多種糖化血紅蛋白變異體的能力有了明顯提高，基本可以達到臨床需求，但是還存在眾多干擾因素［13］。

本研究表明：人體內的HbA1c＜16.3%時IE－HPLC 檢測HbA1c相關系數r＝0.997；95%CI 為－0.31～0.67；偏差（%）為－5.8%～4.3%結果無顯著干擾。隨著HbA1c濃度增加，正干擾逐漸遞增。當TG≤20.78mmol／L 時IE－HPLC 檢測HbA1c結果相關系數r＝0.995；95%CI 為－0.26～0.50；偏差（%）為－5.5%～5.8%結果無顯著干擾。TBIL≤342.1 μmol／L對IE－HPLC檢測HbA1c相關系數r＝0.994；95%CI為－0.09～0.50；偏差（%）為－5.5%～4.1%結果無顯著干擾，隨著膽紅素濃度增加，負干擾逐漸遞增，與廠家聲明干擾因素及本課題組前期外源性高血脂高膽紅素對HbA1c的干擾相一致［14］。

在日常工作中，實驗室工作人員面對復雜多樣標本，要在短時間內檢測出正確結果，需要每個從業者了解每種HbA1c檢測原理，能根據患者本身情況選擇更合適的檢測HbA1c的方法。

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