用喹諾酮誘導銅綠假單胞菌獲得耐藥質粒的研究＊

羅史科，劉鮮花，伍 和，金 嫻，樊春卉，朱平安

（鹽田區人民醫院檢驗科，廣東深圳518081）

銅綠假單胞菌（PA）是條件致病菌也是醫院感染細菌的重要成員，隨著抗菌藥物應用人群的不斷擴大，PA 對喹諾酮耐藥性有不斷上升的趨勢［1］。已獲得耐藥質粒的PA 菌株對抵抗力弱的人群有時是致命的［2］。及時發現細菌獲取耐藥性的能力，破解細菌耐藥質粒是人類應對PA 的途徑之一。因此研究PA 誘變獲取耐藥質粒的過程及機制有一定的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2012年1月到2013年12月本院各科送檢細菌培養的合格臨床標本，一共481份。

1.2 儀器與試劑 主要儀器包括DNA 自動加熱循環器（美國Perkin Elmer公司）、紫外線分析儀、epp偏振照相儀、酶標分光光度計，微型、水平和垂直電泳儀，MPRA4I高速冷凍離心機、真空干燥機、培養搖床、超低溫冰箱、法國梅里埃細菌鑒定儀。主要耗材和試劑包括血培養皿、普通瓊脂培養皿，PA標準菌株ATCC27853（由深圳北大醫院檢驗科劉小平主任惠贈），奈啶酸、環丙沙星藥敏紙片，質粒提取試劑（深圳雅瑞爾科技公司提供），引物（上海Introvigen公司合成）。

1.3 方法

1.3.1 PA 菌的獲取［3］481份樣品接種于血培養皿，挑取單個菌落用梅里埃細菌鑒定儀鑒定為PA 菌株，均與標準菌株ATCC27853比對，共獲得31份PA 樣品。

1.3.2 對喹諾酮敏感的PA 菌株的挑選 用K－B紙片瓊脂擴散法進行。根據CLSI藥敏試驗執行標準判斷敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）［4］。31份PA 菌株經奈啶酸、環丙沙星紙片藥敏試驗后分為耐藥PA 菌株15份，敏感PA 菌株16份。16份對喹諾酮敏感PA 菌株則為備用菌，每一份備用菌用2 個2 mL EP管（塑料帶蓋離心管）加甘油分別保存然后將備用菌迅速放入－80 ℃。

1.3.3 敏感PA 菌株誘變為耐喹諾酮藥物菌株 （1）復蘇及編號：將16份備用菌每份取出一管按收取時間順序分別編為P1～P16號并迅速解凍復蘇；（2）接種并進行藥敏試驗：將復蘇備用菌分別接種到對應編號的普通瓊脂平板上，在每一個瓊脂平板中央加入環丙沙星藥物紙片；（3）中介菌落的轉種：挑選最靠近抑菌圈的PA 菌株，將P1～P16平板上的中介PA 菌株轉種到編號為A1－1～A1－16平板，A1－1～A1－16平板上的中介菌再次轉種編號為A2－1～A2－16平板，以此類推，直到出現完全耐藥PA 為止。

1.3.4 誘變耐藥PA質粒的提取［4］取出誘變后耐藥的PA菌株放入增菌液過夜，增菌后PA 菌株提取質粒。按堿裂解細菌、離心吸附柱結合DNA、洗去雜質的步驟提取質粒DNA，提取的質粒光密度比值（A260／A280）在1.8～2.0之間。平均細菌提取的質粒濃度有3.19μg／mL（一般情況下是2～5μg／mL）。

1.3.5 質粒、染色體DNA 的PCR 擴增、序列分析及核酸雜交

1.3.5.1 引物設計合成 依據GenBank提供的基因序列，使用Primer Premier 5設計針對各喹諾酮耐藥基因（PMQR）基因變異體的共有序列的通用引物qnrA－F：ATC TCT CAC GCC ACC GTA TG，qnrA－R：GAT CATC ACG GGT TAG GTC A；qnrB－F：ACG ATG TAT GG T AGC CGT AA，qnrBR：GAT CGT GTC GTC CAG ATT GG；qnrS－F：ACG ACA TCG ATC GGC TGC GT，qnrS－R：TAG CTG TGC ACG CTT GAG GC；qnrC－F：GAG TTG TAC ATA TTG AGT CG，qnrCR：CAC CTA CGC ATG TAT AGT CA；qnrD－F：CGA GAC AAT CTA CGC GAA TA，qnrD－R：AGC ATG CTG AGC GCA TGC TA；aac（6′）－Ib－F：TTG CGA TGC TCT ATG AGT CGC TA，aac（6′）－Ib－R：CTC GAA TGC CTG GCG TGT TT；qepA－F：AAC TGC TTG ACC CCG TAT AT，qepA－R：GTC TAC GCC ATG GAC CTC AC 依照多重PCR 的要求優化反應條件，用于擴展目的基因。合成的引物臨用前稀釋，將裝有引物的EP管5 000r／min離心1min，加入少量的去離子水，使引物濃度為10μmol／L，分裝后置于－20 ℃保存待用。

1.3.5.2 PMQR 基因的PCR 擴增與測序 耐藥PA 菌株篩選PMQR 質粒，進行多重PCR 反 應（qnrA／qnrB／qnrS／qnrC／qnrD）的反應體系，共50μL：Premix Ex Taq 25μL，qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD 的引物（包括上、下游）各1μL。DNA模板4μL、水11μL。PCR 反應條件為94 ℃預變性5min；94℃變性45s，53 ℃退火45s，72 ℃延伸60s，共35個循環；最后72 ℃延伸10min。

1.3.5.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物 稱取1.20g瓊脂粉放入三角燒瓶中，加入0.5×TBE緩沖液100mL，微波爐加熱至完全熔化，取出冷卻至58 ℃左右，加入EB 母液（10 mg／mL）至終濃度為0.5μg／mL。緩慢倒入模具中。凝固后將內槽和著凝膠一起放入電泳槽，負極與上樣孔在同一側。加入緩沖液0.5×TBE蓋過凝膠表面。取10×上樣緩沖液2μL與18μL PCR 產物混勻，加到凝膠板上樣孔內，另外選一孔加入6μL dp1000Marker。用100V 直流電源電泳40min，當溴酚藍染料泳動至距離凝膠前沿2cm 處停止電泳，取出凝膠用紫外投射儀內看結果并拍攝照片。

1.3.5.4 序列比對與分析 序列測序委托深圳華大基因公司完成，測序結果使用Chromas、DNAStar、VectorNT1、Suite8等軟件進行查看及序列校正拼接，借助NCBI BLAST 程序（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）與GenBank數據庫比對分析，明確基因亞型、有無突變、突變位點及由此導致的氨基酸改變。

1.4 統計學處理 數據統計分析與圖表制作使用Microsoft Excel2007對試驗數據進行統計和圖表制作。

2 結 果

2.1 PA 完全耐藥株的出現 在第9次誘變轉種后出現A9－3、A9－9 2株完全耐藥株。

圖1 耐藥株質粒DNA 電泳圖

2.2 耐藥菌株提取質粒的電泳 見圖1。

2.3 耐藥株質粒測序及比對 測序結果與Genbank數據庫比對分析，耐藥株質粒基因為qnrS，見圖2（見《國際檢驗醫學雜志》網站主頁“論文附件”）。

3 討 論

與PA 耐藥機制有 關 的 因 素［5－6］主 要 有（1）細 菌 產 生 抗 菌活性酶，如β－內酰胺酶、氨基糖苷鈍化酶等；（2）細菌改變抗菌藥物作用的靶位，如青霉素結合蛋白（PBPs）、DNA 旋轉酶等結構發生改變，從而逃避抗菌藥物的抗菌作用；（3）外膜通透性降低；（4）生物膜形成；（5）主動泵出系統。質粒是宿主細胞核質中存在的雙鏈DNA。喹諾酮類藥物作用于細菌的靶酶為革蘭陰性菌的DNA 旋轉酶及革蘭陽性菌拓撲異構酶。PA 屬于革蘭陰性菌，其產生耐喹諾酮藥物主要是由于DNA 酶結構改變，而質粒的變異是導致DNA 酶改變的主要因素之一。本課題證明PA 在喹諾酮抑菌圈外（低于有效抑菌濃度）連續進行9次轉種誘變，細菌有耐藥質粒檢出，細菌已獲得耐藥性突變。與同一城市不同城區的PA 耐藥性略有不同，深圳市南山區PA 2011～2012年耐藥基因共檢測出11種［7］。ICU 患者及燒傷患者PA 耐藥率遠高于其他患者［8］，耐藥感染致死率明顯高于其他細菌，對PA 不規范用藥導致耐藥應引起足夠重視。蔣崗等［9］對廣州地區PA 常見8種耐藥基因進行分析，發現耐藥率均大于10%。吳俊等［10］研究廣州一家三甲醫院PA 耐藥機制時檢查出大型質粒介導PA 菌株產金屬β－內酰胺酶基因，感染患者病死率高達71%。PA 是容易獲得耐藥質粒的一類條件致病菌，在ICU 及燒傷科感染率高，致死率高，連續低濃度用藥細菌細菌容易突變獲得耐藥性，使用PA 敏感的抗菌藥物一定要定時監測血藥濃度并注意幾種敏感藥物要交替使用。

［1］黃燕新，姜朝新，王陳龍，等.464株銅綠假單胞菌的耐藥性分析及治療［J］.國際檢驗醫學雜志，2013，34（6）：752－754.

［2］李智山，鄧三季.老年患者下呼吸道醫院感染病原菌分布及體外耐藥監測［J］.中華醫院感染學雜志，2004，14（4）：102－104.

［3］張華.醫院獲得性患者銅綠假單胞菌感染分布及藥敏試驗情況［J］.國際檢驗醫學雜志，2014（23）：3230－3231.

［4］倪語星.現代病原學檢驗與臨床實踐［M］.上海：上海科學技術文獻出版社，1999：23－29.

［5］孫光明.整合子介導銅綠假單胞菌獲得性耐藥機制的研究［D］.鎮江：江蘇大學，2013.

［6］張國棟，王瑩，朱紅勝.臨床分離的美羅培南和環丙沙星共同耐藥的銅綠假單胞菌耐藥機制的研究［J］.檢驗醫學，2014，06（6）：646－650.

［7］袁夢，袁月明，陳宏彬，等.銅綠假單胞菌抗生素耐藥性及耐藥相關基因檢測［J］.中國微生態學雜志，2014，26（10）：1140－1145.

［8］胥學冰，史昌乾，張博，等.燒傷后常見感染途徑及其病原菌分布和耐藥性分析［J］.大連醫科大學學報，2014，05（5）：452－455.

［9］蔣崗，徐霖，關琳琳，等.銅綠假單胞菌中質粒介導喹諾酮類耐藥基因的研究［J］.熱帶醫學雜志，2013，13（7）：813－815.

［10］吳俊，趙子文，陳惠玲，等.大型質粒介導泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制及防治對策［J］.中華醫院感染學雜志，2013，23（7）：1487－1489.