齒葉白鵑梅葉中黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究*

李古月，劉佳鑫，才　謙（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110000；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連116600）

齒葉白鵑梅葉中黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究*

李古月1，2，劉佳鑫1，2，才謙3
（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽110000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110000；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，大連116600）

［目的］研究齒葉白鵑梅葉中分離得到的黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用。［方法］以96微孔板法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制作用。［結(jié)果］齒葉白鵑梅葉中多個(gè)黃酮類化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中木犀草素，木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷，芹菜素，芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷，槲皮素，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于阿卡波糖。［結(jié)論］黃酮類化合物可能是齒葉白鵑梅葉具有降糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

齒葉白鵑梅葉；黃酮；α-葡萄糖苷酶；抑制活性

齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.Moore.），是薔薇科繡線菊亞科白鵑梅屬植物［1］。白鵑梅屬分為白鵑梅和齒葉白鵑梅兩個(gè)種，其中白鵑梅主要生長(zhǎng)在中國(guó)的江蘇省、浙江省、安徽省一帶，以其根皮、樹皮入藥，多用于腰膝酸痛的治療［2］。齒葉白鵑梅主要生長(zhǎng)在遼寧省凌源市、喀左縣及河北省一帶。其嫩葉可食用，民間多用其預(yù)防和治療糖尿病。本課題組研究發(fā)現(xiàn)齒葉白鵑梅葉的乙醇和水提取物確有改善小鼠耐糖量及降血糖作用［3］。通過對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，本課題組分離得到多個(gè)以芹菜素、木犀草素、槲皮素為苷元的黃酮類化合物，如芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷等十幾個(gè)化合物［4-5］。為探討齒葉白鵑梅的降糖作用是否與其中含有的黃酮類化合物有關(guān)，闡明該植物降血糖的物質(zhì)基礎(chǔ)，本文將主要觀察齒葉白鵑梅葉中分離得到的這些黃酮單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為解釋其降糖機(jī)制、進(jìn)而為將其開發(fā)成為新的植物降糖藥奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1儀器UV-3100型紫外可見分光光度計(jì)（日本東芝公司）；CP225D型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BS210S電子天平（Sartorius）。

1.2藥品與試劑齒葉白鵑梅葉采自遼寧省凌源市，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王冰教授鑒定為齒葉白鵑梅（Exochorda serratifolia S.）的葉子；α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20，Sigma公司）；對(duì)-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG；0215868010，上海寶曼生物科技有限公司）；對(duì)硝基苯酚（PNP；20040322，湘中地質(zhì)實(shí)驗(yàn)研究所）；阿卡波糖（110105，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；碳酸鈉（Na2CO3），北京化學(xué)試劑公司；其余化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1化學(xué)成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定齒葉白鵑梅葉（2.5kg）用70%乙醇提取2次，每次10倍量，提取2h，合并提取液，減壓回收溶劑，浸膏用蒸餾水稀釋后，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，分別回收溶劑，得乙酸乙酯萃取物54 g和正丁醇萃取物144 g。正丁醇萃取物采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，氯仿-甲醇梯度洗脫，共得到6個(gè)組分。組分5再經(jīng)硅膠柱色譜和Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行分離，分別得到化合物1、2、3；組分6采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，甲醇-乙酸乙酯梯度洗脫，并經(jīng)重結(jié)晶，分別得到化合物4 和5；乙酸乙酯萃取物用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，氯仿-甲醇梯度洗脫，共得到18個(gè)組分，組分4、6、17再分別經(jīng)硅膠柱色譜分離，采用氯仿-甲醇梯度洗脫，再結(jié)合反相硅膠進(jìn)行分離，分別得到化合物6、7、8、9、10。根據(jù)分離得到的化合物的理化性質(zhì)并結(jié)合波譜數(shù)據(jù)，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作根據(jù)采用的反應(yīng)體系，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）配制1 000 μmol/L PNP溶液，稀釋成250、200、150、100、50、25、10、5、2、0 μmol/L。分別取不同濃度的PNP溶液各200 μL，加入0.1 mol/L Na2CO3溶液5 mL，混勻，在405 nm下測(cè)定A值。以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），PNP濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3α-葡萄糖苷酶抑制劑活性測(cè)定根據(jù)Tremblay等［6-8］的方法，即以PNPG為底物，0.1 mol/L Na2CO3為終止液，于405 nm處比色測(cè)定。活力單位定義為：在37℃、pH6.8的條件下，1 min內(nèi)水解PNPG釋放1 μmol PNP所需的酶量。抑制活性即為相同條件下降低1個(gè)酶活力單位所需的化合物的量。

抑制百分比=100%×（總酶活-殘余酶活）/總酶活。

2.4統(tǒng)計(jì)分析按照抑制率（%）=［1-（樣品A實(shí)驗(yàn)組-樣品A空白組）/（對(duì)照A實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照A空白組）］×100%計(jì)算抑制率，并用OriginPro 7.5 SR1軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

3　結(jié)果

3.1分 離得到的化合物結(jié)構(gòu)見圖1，名稱見表1。

圖1　齒葉白鵑梅葉中分離得到的化合物的結(jié)構(gòu)圖

3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線以PNP濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（A）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:= 5.654 7X+0.028 1（r=0.999 2），結(jié)果表明線性關(guān)系良好，線性濃度范圍為：0～250 μmol/L。

3.3樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響按照上述反應(yīng)體系，加入不同體積的各樣品溶液，測(cè)得最大抑制活性及IC50值［9-12］，結(jié)果見表2、圖2。

表1　齒葉白鵑梅葉中分離得到的化合物

結(jié)果表明，從齒葉白鵑梅葉中分離得到的黃酮單體均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-新橙皮糖苷、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D-新橙皮糖苷6個(gè)化合物的抑制率均大于陽性對(duì)照藥阿卡波糖。

表2　齒葉白鵑梅葉中各黃酮單體對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性（n=5）

圖2　齒葉白鵑梅葉中黃酮單體對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

4　討論

在全球范圍內(nèi)，糖尿病已成為日益嚴(yán)重危害人類健康的疾病，為繼心腦血管疾病和腫瘤之后威脅人類的“第三號(hào)殺手”［13-14］。而糖尿病患者的首要目標(biāo)是控制餐后血糖值，避免超高血糖值的出現(xiàn)。食物中的多糖復(fù)合物可由淀粉酶水解為糊精和寡糖，在腸吸收和進(jìn)入血液循環(huán)之前進(jìn)一步由α-葡萄糖苷酶水解，從低聚糖底物的非還原端切開α-1，4-糖苷鍵，釋放出葡萄糖［15-18］，α-葡萄糖苷酶抑制劑通過抑制存在于小腸黏膜微絨毛膜表面的麥芽糖酶和蔗糖酶等水解酶，能夠延緩或減少腸道對(duì)碳水化合物消化與吸收，具有降低餐后血糖的作用［19-20］。

通過檢測(cè)從齒葉白鵑梅葉中分離得到的黃酮類化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)黃酮單體均有表現(xiàn)出一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用，部分化合物的抑制率均大于陽性對(duì)照藥阿卡波糖［21］，結(jié)果表明，黃酮類化合物可能是齒葉白鵑梅葉具有降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

從齒葉白鵑梅葉中分離得到的10個(gè)黃酮單體中，有3個(gè)是黃酮苷元，7個(gè)是黃酮苷，通過比較這兩類黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黃酮苷元的抑制活性普遍高于黃酮。提示苷元成苷后，酶抑制活性會(huì)有不同程度的降低，3個(gè)苷元的酶抑制活性由強(qiáng)到弱順序分別為：芹菜素＞木犀草素＞槲皮素，具體原因還需進(jìn)一步深入研究。

本課題組對(duì)齒葉白鵑梅的化學(xué)成分和藥理作用進(jìn)行了研究，通過糖耐量和降血糖實(shí)驗(yàn)證明了其確有降糖作用，通過化學(xué)成分的分離明確了其中含有的主要化學(xué)成分類型，并建立了含量測(cè)定方法。本文通過從該植物中分離得到的多個(gè)黃酮類成分的α-葡萄糖苷酶作用的研究，初步明確了該植物降糖作用可能與其中的黃酮類化合物抑制α-葡萄糖苷酶有關(guān)，黃酮類化合物可能是其降血糖的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些研究為齒葉白鵑梅的深入研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

［1］傅沛云.東北植物檢索表［M］.第2版.北京:科學(xué)出版社，1995:283-284.

［2］中國(guó)藥材公司.中國(guó)中藥資源志要［M］.北京:科學(xué)出版社，1994:508.

［3］王聰，劉玉強(qiáng)，才謙.齒葉白鵑梅葉對(duì)小鼠糖耐量的影響及降糖作用研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2011，17（2）: 283-284.

［4］才謙，王靈芝，劉玉強(qiáng)，等.葉白鵑梅葉化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2012，43（4）:673-675.

［5］才謙，王聰，劉玉強(qiáng).齒葉白鵑梅葉中黃酮類成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（3）:190-191.

［6］Pierre C，Roland RT.P-Nitrophenol-α-glucopyranoside as substrate for measurement of maltase activity in human semem ［J］.J Clin Chem，1978，24:208-211.

［7］俞靈鶯，李向榮，方曉.桑葉總黃酮對(duì)糖尿病大鼠小腸雙糖酶的抑制作用［J］.中華內(nèi)分泌雜志，2002，18（4）:313.

［8］袁海波，沈忠明，殷建偉，等.五味子中α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)小鼠的降糖作用［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002，23 （3）:112-114.

［9］李宏，黃金山，胡浩，等.桑葉對(duì)α-葡萄糖苷酶活力的影響及降糖機(jī)理的研究［J］.中國(guó)蠶業(yè)，2003，24（2）:19.

［10］張捷平，黃玲，施紅.降糖補(bǔ)陰中藥對(duì)α-糖苷酶的影響［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，13（10）:29-30.

［11］原愛紅，黃哲，馬駿，等.桑葉黃酮的提取及其降糖作用的研究［J］.中草藥，2004，35（11）:16.

［12］林玉桓，王栩林，王穎，等.34種中藥對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用［J］.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，23（4）: 270-272.

［13］楊麗君，辛效毅.中醫(yī)藥治療糖尿病現(xiàn)狀［J］.河南中醫(yī)，2013，33（5）：650-652.

［14］劉志邦，顧琴，顧群，等.我國(guó)中醫(yī)藥治療糖尿病的現(xiàn)狀與展望［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，20（2）:130-134.

［15］吳琦，楊秀偉，鄒磊，等.α-葡萄糖苷酶抑制活性跟蹤分離芙蓉菊中的活性成分［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34 （17）:2206-2209.

［16］Matsui T，Kobayashi M，Hayashida S，et al.Luteolin，a flavone，does not suppress postprandial glucose absorption through an inhibition of alpha-glucosidase action［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2002，66（3）:689-692.

［17］高小平，張蔚瑜，皺文俊，等.中藥提取物中α-葡萄糖苷酶抑制的篩選［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15（6）:536-538.

［18］白鋼，王冬莉，曹學(xué)琳，等.中藥中α-糖苷酶抑制劑的篩選［J］.南開大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，37（3）:98-102.

［19］趙培西，王四旺.中藥有效成分降血糖作用的研究進(jìn)展［J］.陜西中醫(yī)，2004，25（11）:1048-1049.

［20］顧覺奮，陳紫娟.α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究及應(yīng)用［J］.藥學(xué)進(jìn)展，2009，33（2）:62-67.

［21］趙濱，沈廣威.α糖苷酶抑制劑阿卡波糖治療IGT的臨床觀察［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（16）:136-137.

Inhibitory activity of flavonoids isolated from Exochorda serratifolia S.Moore.on α-glucosidase

LI Gu-yue1，2，LIU Jia-xin1，2，CAI Qian3
（1.The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110000，China；2.Pharmacy College of China Medical University，Shenyang 110000，China；3.Pharmacy College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

［Objective］To investigate the inhibitory activity of flavonoids isolated from Exochorda serratifolia S. Moore.leaves on α-glucosidase.［Methods］Inhibitory activity of α-glucosidase was screened by the 96-microplatebased method.［Results］The flavonoids showed inhibitory activity on α-glucosidase.Among them，luteolin，luteolin-7-O-β-D-neospheroside，apigenin，apigenin-7-O-β-D-neospheroside，quercetin，quercetin-3-O-β-D-glucoside showed stronger inhibitory activity than acarbose.［Conclusion］Flavonoids may be the substances basis of Exochorda serratifolia S.Moore.leaves with inhibitory activity of α-glucosidase.

Exochorda serratifolia S.Moore.；flavonoids；α-glucosidase；inhibitory activity

R285.5

A

1673-9043（2015）03-0165-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.03.10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202919）。

李古月（1984-），女，藥師，從事臨床制劑指導(dǎo)工作。

（2014-02-05）