實時熒光定量逆轉錄—聚合酶鏈反應（RT—PCR）法與細胞培養法檢測流行性感冒病毒的比較

姜紅濤 姚秀林

[摘要] 目的 比較實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法與細胞培養法檢測流行性感冒病毒的差異。方法 采用實時熒光定量RT-PCR及經典的狗腎傳代細胞病毒分離2種方法，同時對流感監測點送檢的80份疑似流感標本檢測流感病毒。 結果 細胞培養病毒分離的陽性數為26份，實時熒光定量RT-PCR的陽性數為36份，χ2=8.1， P<0.005。 結論 通過該實驗，驗證了實時熒光定量RT-PCR的確快速敏感，適用于實驗室快速診斷。

[關鍵詞] 實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應；細胞培養法；流感病毒

[中圖分類號] R4 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）03（b）-0192-02

2013年出現的流感病毒H7N9經自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來極度恐慌，引起WHO 的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學的準確快速診斷顯得尤為重要。該實驗室在2014年1月采用整群抽樣法對撫順市流感監測哨點醫院的80份疑似流感樣標本進行了實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法與細胞培養法進行了檢測流行性感冒病毒的方法比較，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月在撫順市國家級流感監測哨點醫院，每周采集內科和兒科門診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標本，放人pH 7.4-7.6的DMEM采樣液中，當日低溫送流感實驗室檢測，每周采集 20份流感樣病例的咽拭子標本。

1.2 主要試劑

①抗A（H1N1）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國家流感中心提供。MDCK細胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V， 采購于BI公司。DMEM培養基，采購于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3 主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養箱 ；倒置顯微鏡等。

1.4 實驗方法

1.4.1 采用細胞培養法分離流感病毒，細胞為狗腎傳代細胞（MDCK） 每份標本接種細胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hanks液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5 ℃培養，每天觀察病理變化（CPU），當CPU出現3～4個加號時，按常規法檢查維持液中的紅細胞凝集活性。將HA≥1：16的標本采用血凝抑制方法（HI）進行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國家流感中心做進一步鑒定。HA≤1：16的標本未做分型鑒定。

1.4.2 RT-PCR反應體系的配置[3-4] 反應條件：60℃ 5min→ 50℃ 30min→ 95℃ 15min→95℃ 15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸 30s 45 cycle→ 72℃ 5min→4℃ 保存。見表1。

1.5 統計方法

配對設計的χ2檢驗，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的結果

細胞培養分離病毒26株，陽性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽性百分率45.00%，見表2。

2.2 兩種檢驗方法統計結果比較

細胞培養分離病毒36株，陽性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗方法統計結果為χ2=8.1，因為χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，兩種檢驗方法敏感性差異有統計學意義。見表3。

2.3 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的分型結果

細胞培養分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3 討論

流感病毒病原學相關檢測目前常用的有病毒分離培養法、快速檢測、分子生物學方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標準[5]，但耗時長是其缺點。而且宿主細胞生長狀態也是影響病毒生長及復制的關鍵因素[6]，導致疑似流感樣標本到實驗室后，培養完成時間不確定。同時培養液中營養物質的持續消耗以及宿主細胞的逐漸死亡是導致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標本采集后的保存運送等環節都對MDCK培養分離流感病毒存在較大的影響。而實時熒光定量RT-PCR法應用于流感病毒實驗室診斷，國內外早已有許多報導[8]，它具有靈敏度高、特異性好、檢測所需時間短等等優點，尤其在應急疫情快速診斷中得到了廣泛的應用。它與經典的MDCK細胞分離法相比，檢測時間可縮短到1 d之內。由于在封閉管中進行，省略了電泳這一步驟，減少了以往PCR技術導致的假陽性可能[8]。

該實驗室對2014年1月流感監測點送檢的80份標本，采用細胞培養、實時熒光定量RT-PCR 兩種方法檢測，同時進行比較， 結果證實，實時熒光定量RT-PCR法對流行性感冒病毒的檢出率為45.00%，高于細胞培養法的病毒檢出率32.50%。實時熒光定量RT-PCR法和細胞培養法兩種檢驗方法χ2檢驗結果為χ2=8.1，P<0.005。對流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對流感病毒的分型也是準確無誤，在病毒含量較低的標本中不存在漏檢情況發生。通過這兩種方法的比較，與浙江省疾病預防控制中心通過比較得出的，實時熒光定量RT-PCR法對大量疑似標本進行實驗室快速鑒別診斷，實用性強，快速敏感[9]的結論一致。驗證了實時熒光定量RT-PCR法確實是實驗室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實時熒光定量RT-PCR法檢測為流感病毒陽性的標本接種MDCK細胞，培養分離流感病毒，可以降低細胞培養法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測效率。這僅僅是本實驗室的驗證結論，還需要其它研究中心加以驗證。

[參考文獻]

[1] WHO. Human infection with influenza A（H7N9）virus in Chi-na[J].N Engl J Med， 2013（368）：1888-1897.

[2] 中國疾病預防控制中心.全國流感/人禽流感監測實施方案（2005—2010年度）[Z].2005-09.

[3] 《流行性感冒診斷標準》WS285-2008[S].

[4] WHO. Sequencing primers and protocol[EB /OL]http： / /www . who. int/entity/csr/resources/publications/swineflu/GenomePrimers_20090512.pdf，2011 /2011 ，11，08.

[5] 劉建軍，程小雯，賀建華.用雞胚和MDCK細胞分離流感病毒的實驗研究[J].中國公共衛生，2002（8）：335-336.

[6] 馮婷，殷仲偉，李晉蓉. 流感病毒H1N1在MDCK細胞的培養及純化條件的優化[J].中國病原生物學雜志，2012，7（7）：493-496.

[7] Youil R，Su Q，Toner TJ， et al，Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines [J].J Virol Methods，2004（120）：23-31.

[8] Von Elden，Kenton Lohman，Luke TDaum.Simutanous Detection ofInfluenza viruses A and B using Real-Time Quantitative PCR[J].Journal of clinical Microbiology，2003，39（1）：3597-3601.

[9] 李嬋，盧亦愚，等.實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法與RT-PCR法及細胞培養法檢測甲3型流行性感冒病毒的比較[J].中國計劃免疫，2005，11（5）：360-363.

（收稿日期：2014-12-16）