補骨脂單體成分對體外培養成骨細胞和破骨細胞分化的影響*

柴麗娟，樊　娜，王　虹，，張　晗，王少峽，，苗　琳，毛浩萍，周　昆（.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津30093；.天津中醫藥大學，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津30093）

·中藥研究·

補骨脂單體成分對體外培養成骨細胞和破骨細胞分化的影響*

柴麗娟1，樊娜1，王虹1，2，張晗1，王少峽1，2，苗琳1，毛浩萍2，周昆2
（1.天津中醫藥大學，天津市現代中藥重點實驗室，天津300193；2.天津中醫藥大學，天津市中藥藥理學重點實驗室，天津300193）

［目的］研究補骨脂單體成分異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對體外培養破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）及成熟破骨細胞形成數目、體外培養成骨細胞增殖與分化的影響。［方法］體外采用巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受體活化因子配體（RANKL）誘導培養破骨細胞前體細胞，考察異補骨脂素、異補骨脂素查爾酮對破骨細胞前體細胞在分化過程中其標志性酶TRACP的活性和成熟破骨細胞產生數目的影響。對硝基苯磷酸鹽法（PNPP法）測定破骨細胞TRACP活性，TRACP細胞染色法鑒定并檢測成數破骨細胞數目。酶消化法體外培養新生小鼠成骨細胞，（CCK-8）（cell counting kit-8）法檢測兩成分對成骨細胞增殖的影響，磷酸苯二鈉法測定兩成分對成骨細胞標志性酶堿性磷酸酶（ALP）的影響。［結果］體外成功培養小鼠破骨細胞和成骨細胞，兩細胞強表達各自的標志性酶TRACP和ALP。異補骨脂查爾酮在0.05 μmol/L濃度下對成熟破骨細胞的形成有顯著抑制作用。異補骨脂素在0.1 μmol/L濃度下對成骨細胞增殖有顯著促進作用。［結論］補骨脂單體成分異補骨脂素對成骨細胞有促進作用、異補骨脂查爾酮對破骨細胞有抑制作用，提示補骨脂可能作為抗骨質疏松或骨吸收的藥物。

異補骨脂素；異補骨脂查爾酮；成骨細胞；破骨細胞；增殖；分化

骨質疏松癥發病率已躍居常見病、多發病的第7位［1］，如何預防和治療骨質疏松癥日益受到普遍重視。無論是I型還是II型骨質疏松癥，都與雌激素缺乏有直接或間接關系［2-4］，臨床上應用雌激素治療骨質疏松癥有效但存在引起癌癥的風險，利用植物雌激素防治骨質疏松癥成為目前關注的焦點。

補骨脂為豆科植物補骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）的干燥果實，具有溫腎助陽、納氣止瀉的功效，臨床治療骨質疏松癥有效［5-7］，其有效成分具有雌激素樣活性［8］，課題組前期研究也證實，補骨脂的活性成分具有與雌激素受體［9］、雄激素受體［10］的結合能力。補骨脂含有多種活性成分，體外單體成分的研究是其藥理研究的基礎，本研究主要探討補骨脂單體成分異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對體外培養破骨細胞、成骨細胞的增殖與分化作用，為補骨脂的臨床使用及新藥研發提供依據。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡雌性昆明小鼠、乳鼠購自中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所實驗動物中心［動物合格許可證：SCXK（軍）2009-003］，改良型α-MEM培養基（Hyclone），FBS（Invitrogen），巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、核因子κβ受體活化因子配體（RANKL）（R&D），低糖型DMEM、Ⅱ型膠原酶、Acid Phosphatase Leukocyte（TRAP）Kit（Sigma），CCK-8（日本同仁化工），補骨脂素（中國食品藥品檢定研究所），補骨脂酚（MUST）。其它試劑均為市售分析純產品。多功能讀板機（Felex station 3，MD，美國）；超聲破碎儀（VCX 130，Sonics，USA），倒置熒光顯微鏡（TE300，Nikon，日本），CO2培養箱（Thermo，美國），酶標儀（PE，美國）。

1.2體外破骨細胞前體細胞誘導培養脫臼處死4～6周雌性昆明小鼠，75%乙醇消毒后取四肢長骨，去除骨表面軟組織和骨骺，置入保持低溫的α-MEM全培基（15%FBS，1%雙抗）中。用1 mL注射器吸取全培基，反復沖洗骨髓腔和骨內表面，直至骨壁變白為止。骨髓懸液用200目細胞篩過濾，將過濾后的細胞懸液均勻接種至75 cm2培養瓶中，37℃，5%CO2培養箱培養24 h。24 h后將未貼壁的細胞和全培基倒入50 mL離心管中離心，棄去上清液，加入一定量全培基，混勻細胞后計數，調節細胞濃度至5×106個/mL。將細胞懸液接種到相應培養板，培養48 h后，吸去全培基去除未貼壁細胞，加入DHanks輕輕洗滌細胞兩次，加入含或不含藥物的含有刺激因子全培基。刺激因子濃度為M-CSF，10 ng/mL和RANKL，30 ng/mL。

1.3小鼠成骨細胞體外培養取出生2～3 d的昆明小鼠15只，75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取顱蓋骨，去除骨膜和軟組織，0.25%的胰酶37℃氣浴消化15 min；取出骨片，將顱骨片剪成約1 mm×1 mm大小的骨片；加入0.1%Ⅱ型膠原酶37℃氣浴搖床中振蕩消化90 min；吸取上清液，丟棄骨片；放入另一個50 mL離心管中離心收集細胞，加入完全培養基（低糖型DMEM，FBS 15%，雙抗1%）重懸細胞，將細胞懸液移入75 cm2培養瓶中。顯微鏡下可以看到許多圓形的細胞。37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中，每3天換液1次，待細胞長滿瓶底后傳代備用。改良Gomori法鑒定成骨細胞。

1.4異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對破骨細胞TRACP表達的影響將原代取材破骨細胞前體細胞經過48 h貼壁洗滌后，加入含或不含RANKL和M-CSF的α-MEM全培基進行刺激。刺激同時加入異補骨脂素或異補骨脂查爾酮進行藥效研究，培養7 d后對硝基苯磷酸鹽法（PNPP）法檢測破骨細胞抗抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）活性。細胞加藥分組如下：1）對照組：正常培養基；2）模型組：含M-CSF 10 ng/mL，RANKL 30 ng/mL的全培基（M10R30）；3）異補骨脂素高中低劑量組：在模型組基礎上含有0.05、0.1、0.5 μmol/L的異補骨脂素；4）異補骨脂查爾酮高中低劑量組：在模型組基礎上含有0.05、0.1、0.5μmol/L的異補骨脂查爾酮。

PNPP法檢測小鼠破骨細胞TRACP酶活性：吸除需檢測96孔板細胞培養上清液，加入D-Hanks液清洗細胞2次，加入0.1%Triton X-100裂解10 min，加入PNPP反應液（PNPP 2 g/L，L-酒石酸鈉7.6 g/L）100 μL在37℃下孵育30 min，加入100 μL 1 mol/L的NaOH終止。405 nm多功能讀板機上讀值。

1.5補骨脂素、補骨脂酚對TRACP陽性多核成熟破骨細胞形成數目的影響將原代取材破骨細胞前體細胞經過48 h貼壁洗滌后，加入含或不含RANKL和M-CSF的α-MEM全培基進行刺激。刺激同時加入異補骨脂素或異補骨脂查爾酮進行藥效研究，培養14 d后進行破骨細胞染色計數。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計數TRACP陽性并且核≥3個的視為成熟破骨細胞。分組同上。破骨細胞染色根據Acid Phosphatase Leukocyte（TRAP）Kit試劑盒說明書進行。

1.6補骨脂素、補骨脂酚對體外培養小鼠成骨細胞增殖的影響待細胞長滿瓶底后傳代，種入96孔板中，2×104個/mL種入，待細胞生長至50%融合時，加入含異補骨脂素或異補骨脂查爾酮的全培基（含2% FBS），培養7 d后，CCK-8法檢測細胞增殖情況。細胞加藥分組如下：1）對照組：正常培養基；2）異補骨脂素高中低劑量組：0.05、0.1、0.5 μmol/L；3）異補骨脂查爾酮高中低劑量組：0.05、0.1、0.5 μmol/L。

1.7補骨脂素、補骨脂酚對體外培養小鼠成骨細胞ALP表達的影響細胞長滿瓶底后傳代，種入96孔板中，待細胞生長至70%融合時，加入含異補骨脂素或異補骨脂查爾酮的全培基（含2%FBS），培養7 d后，磷酸苯二鈉比色法測定成骨細胞ALP的表達情況。細胞加藥分組同上。

成骨細胞ALP測定：磷酸苯二鈉法測定成骨細胞ALP酶的表達情況，510 nm讀取吸光度。

1.8統計學處理使用SPSS 18.0統計軟件進行分析，計量資料均以均數±標準差（±s）表示。正態分布計量資料的組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗，偏態分布計量資料的組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1破骨細胞、成骨細胞培養鑒定顯微鏡下觀察誘導培養7 d的破骨細胞，細胞邊緣不規則，有突起和偽足，胞漿可見大小不等的空泡，呈現吞噬樣細胞形態，體積大，直徑約100 μm，含有2～50個緊密堆積的核。TRACP高表達是破骨細胞主要標志性酶，研究所培養破骨細胞經TRACP染色后，可見大量多核細胞，胞漿呈現出均勻分布的紫紅色或棕紅色顆粒，部分胞漿內可見大小不一的空泡，說明本研究培養的破骨細胞TRACP表達強，具有破骨細胞的主要生物學特征。見如圖1。

原代培養成骨細胞呈圓球狀，透明，分散存在，大小均一。培養24 h后，細胞已完全貼壁展開。展開后的細胞形態多不規則，呈三角形、多角形，有較多突起，胞漿豐富、清晰。生長期細胞分裂多見，細胞多突起互相連接。匯合時細胞呈鋪路石狀，并可重疊生長（如圖1）。在pH9.4條件下，成骨細胞標志酶ALP使孵育液中β-甘油磷酸鈉水解產生磷酸根，經過一些列反應最后生成CoS棕黑色沉淀。研究所培養成骨細胞經胞質呈灰黑色、深黑顆?；蚱瑺畛恋?，說明原代培養成骨細胞ALP含量高，具有成骨細胞的主要生物學特征。

圖1　小鼠破骨細胞、成骨細胞原代培養及鑒定Fig.1　Primary culture and identification of mouse osteoclast and osteoblast

2.2異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對破骨細胞TRACP酶活性的影響M-CSF和RANKL可以顯著誘導破骨細胞TRACP酶的表達，異補骨脂素、異補骨脂查爾酮有降低其表達的趨勢，但沒有統計學差異。見表1。

表1　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對M10R30誘導下破骨細胞TRACP表達的影響（±s）Tab.1　The expression of TRACP in osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

表1　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對M10R30誘導下破骨細胞TRACP表達的影響（±s）Tab.1　The expression of TRACP in osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別n異補骨脂素異補骨脂查爾酮TRACP（占對照組比例）TRACP（占對照組比例）對照組241.00±0.341.00±0.34模型組242.33±0.54*2.33±0.54*低劑量組121.94±0.622.06±0.47中劑量組121.88±0.612.07±0.54高劑量組121.96±0.822.20±0.55

2.3異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對成熟破骨細胞形成數目的影響模型組在M10R30誘導下可以提高成熟破骨細胞的形成數目，具有統計學差異（P＜0.05）。異補骨脂素在不同濃度下對成熟破骨細胞形成的沒有影響；異補骨脂查爾酮在0.05、0.1、0.5 μM濃度下有降低破骨細胞形成的趨勢，以低亮劑量0.05μmol/L濃度下作用顯著。見表2。

表2　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對M10R30誘導下成熟破骨細胞形成數目的影響（±s）Tab.2　The number of mature osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）個

表2　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對M10R30誘導下成熟破骨細胞形成數目的影響（±s）Tab.2　The number of mature osteoclasts induced by M10R30 treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）個

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

TRACP陽性且胞核≥3的細胞數對照組600.9±01.400.9±01.4模型組642.9±30.6*42.9±20.0*低劑量組942.8±19.316.5±08.3#中劑量組941.0±16.229.3±10.5高劑量組939.0±14.030.5±11.7組別n異補骨脂素異補骨脂查爾酮TRACP陽性且胞核≥3的細胞數

2.4異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對成骨細胞增殖、分化的影響成骨細胞增殖期，成骨細胞數目顯著增加形成多層細胞，并合成、分泌Ⅰ型膠原以便最終可以礦化形成骨結節。從表3可以看出，異補骨脂素0.1 μmol/L中濃度劑量下對體外培養小鼠成骨細胞增殖有顯著促進作用（P＜0.05），異補骨脂查爾酮無此作用。ALP是成骨細胞合成分泌的標志性功能酶，分解有機鹽、誘導鈣鹽沉積，促進類骨質礦化。兩成分對體外培養小鼠成骨細胞ALP的表達沒有影響。見表3。

表3　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對成骨細胞增殖與分化的影響（±s）Tab.3　The proliferation and differentiation in mouse osteoblast treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

表3　異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對成骨細胞增殖與分化的影響（±s）Tab.3　The proliferation and differentiation in mouse osteoblast treated by isopsoralen or isobavachalcone（±s）%

注：與對照組相比，*P＜0.05。

異補骨脂素異補骨脂查爾酮（占對照組比例）（占對照組比例）增殖分化增殖分化對照組91.00±0.301.00±0.101.00±0.301.00±0.10低劑量組60.98±0.100.94±0.201.02±0.100.93±0.20中劑量組61.39±0.60*0.88±0.100.98±0.200.82±0.20高劑量組61.03±0.201.06±0.400.97±0.200.94±0.20組別n

3　討論

破骨細胞是骨質疏松過程中行使骨吸收的主要功能細胞，但其培養及純化難度較大，且為終末分化細胞，不能傳代，因此破骨細胞大量培養仍難以實現。其主要來源于單核-巨噬細胞系前體細胞，破骨細胞前體細胞在骨營養激素和骨微環境因子調節下，由多個單核細胞融合變成多核巨細胞，含有2～50個緊密堆積的核，直徑約100 μm左右。體外破骨細胞培養方法較多，如機械分離法、骨髓誘導培養法、脾干細胞誘導法、RAW264.7細胞誘導法、外周血單核細胞誘導法等。研究選用骨髓誘導培養法可使單核細胞定向分化為破骨細胞，獲得較多的破骨細胞，是實驗室較為理想的體外破骨細胞培養方法。

現普遍接受的觀點是：破骨細胞，巨噬細胞，單核細胞共同來源于同一造血干細胞。巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）促進造血干細胞分化為單核巨噬細胞克隆形成單位（CFU-M），并維持其增殖和分化能力。這些單核前體細胞移位至骨吸收區域，在M-CSF持續作用下分化為破骨細胞前體，隨后在M-CSF和RANKL等因子協同作用下，融合為多核破骨細胞，此時細胞開始呈現TRACP陽性，直至破骨細胞成熟，只有成熟的破骨細胞才具有骨吸收能力。M-CSF和RANKL是破骨細胞分化與活化所必須的兩種因子。多核破骨細胞經RANKL和其它因子刺激活化，發揮骨吸收功能。TRACP及骨吸收活性等指標常被用來辨別破骨細胞分化過程中所處階段。成熟破骨細胞內含有大量TRACP酶，破骨細胞行使骨吸收時，TRACP由破骨細胞內溶酶體樣結構中分泌至骨吸收表面，將骨橋蛋白以及骨連素等非膠原骨基質蛋白去磷酸化，從而有利于破骨細胞與骨吸收處表面的黏接，它是破骨細胞的一種標志酶。

研究認為成熟的破骨細胞具有3個核以上，并且TRACP強表達。破骨細胞TRACP活性檢測表明，異補骨脂素、異補骨脂查爾酮對分化過程中破骨細胞標志酶TRACP酶沒有影響，但異補骨脂查爾酮在不同濃度下有降低成熟破骨細胞形成數目的趨勢，尤其在0.05 μmol/L濃度下可以顯著降低破骨細胞的形成。這與Park CK等［11］的研究相吻合之處，他們也報道補骨脂查爾酮（Bavachalcone）通過對ERK、Akt、c-Fos和NFATc1干預抑制破骨細胞形成，認為補骨脂查爾酮可以作為治療關于骨吸收疾病的藥物。

成骨細胞的來源主要有骨（新生動物或胚胎動物顱骨）、骨膜和骨髓間充質干細胞，成骨細胞骨形成過程中經過增殖、分化、礦化和凋亡4個階段，一般認為，ALP是成骨細胞分化的代表性酶，在體外鈣化中起關鍵性作用。本研究培養的成骨細胞ALP染色呈陽性，證明研究采用的成骨細胞具有強的分泌ALP的能力，符合成骨細胞的生物學特征。

關于補骨脂對體外成骨細胞作用研究的較多，如補骨脂水提液、醇提液、補骨脂有效成分對成骨細胞的增殖、分化、成骨細胞骨生成的相關指標如膠原酶的合成、骨保護素（OPG）分泌、骨鈣素分泌，增加鈣化結節等各項研究都已開展很多。如異黃酮和補骨脂二氫黃酮可以促進成骨細胞的增殖［12］，補骨脂素10 μmol/L能促進成骨細胞增殖［13-14］，與他們的研究相類似，本研究也發現異補骨脂素在0.1 μmol/L濃度時可以促進成骨細胞的增殖。兩者對成骨細胞ALP表達沒有促進作用。

中藥成分復雜，中藥有效單體成分的藥理機制是中藥藥理研究的前提。本研究發現補骨脂的單體成分異補骨脂查爾酮能抑制破骨細胞的形成，異補骨脂素能促進成骨細胞的增殖。提示補骨脂的有效單體成分可能協同起效，有的成分促進成骨細胞功能，有的成分抑制破骨細胞功能，糾正骨質疏松過程中破骨細胞與成骨細胞之間的失衡，說明補骨脂具有進一步研發成抗骨質疏松或骨吸收新藥的前景。

［1］王洪復.骨質疏松癥藥效研究方法與技術［M］.北京:人民衛生出版社，2009:9-220

［2］Riggs BL，Khosla S，Melton LJ.A unitary model for involutional osteoporosis:estrogen deficiency causes both type I and type II osteoporosis in postmenopausal women and contributes to bone loss in aging men［J］.Journal of Bone and Mineral Research，1998，13（5）: 763-773.

［3］Khosla S.Update in Male Osteoporosis［J］.The Journal of clinical endocrinology and metabolism，2010，95（1）:3-10.

［4］LeBlanc Et，Nielson CM，Marshall LM，et al.The effects of serum testosterone，estradiol，and sex hormone binding globulin levels on fracture risk in older men［J］.J Clin Endocrinol Metab，2009，94（9）: 3337-3346.

［5］趙丕文，王大偉，牛建昭.紅花等10種中藥的植物雌激素的活性研究［J］.中國中藥雜志，2007，32（5）:436-439.

［6］畢月玲，李晶，李平.單味中藥治療骨質疏松的研究進展［J］.天津中醫藥，2009，26（6）:524-526.

［7］王崢.補腎填精法治療骨質疏松癥［J］.天津中醫學院學報，1998，17（1）:10.

［8］黃劍，趙陸華，鄒巧根.補骨脂化學成分及藥理研究進展［J］.藥學進展，2000，24（4）:212-214.

［9］XinD，Wang H，Yang J，et al.Phytoestrogens from psoralea corylifolia revealestrogenreceptor-subtypeselectivity［J］.Phytomedicine，2010，17（2）:126-131.

［10］苗琳，馬尚偉，樊官偉，等.補骨脂酚拮抗AR轉錄活性抑制雄激素誘導的前列腺癌細胞LNCaP的增殖［J］.天津中醫藥，2013，30（5）:291-293.

［11］Park CK，Lee Y，Chang EJ，et al.Bavachalcone inhibits osteoclast differentiation through suppression of NFATc1 induction by RANKL［J］.Biochem Pharmacol，2008，75（11）:2175-2182.

［12］Wang D，Li F，Jiang Z.Osteoblastic proliferation stimulating activity of Psoralen corylifolia extracts and two of its flavonoids［J］.Planta Medica，2001，67（8）:748-749.

［13］安亞蘭，王建舫，許水明，等.補骨脂水提液及補骨脂素對體外培養成骨細胞的影響［J］.畜牧獸醫學報，2009，40（2）:266-271.

［14］王建華，王艷，潘永梅.補骨脂素對大鼠成骨細胞增殖與分化的影響［J］.天然產物研究與開發，2007，19（5）:844-846.

（本文編輯：高杉，張震之）

The effects of psoralen components on mice osteoblast and osteoclast differention in vitro

CHAI Li-juan1，FAN Na1，WANG Hong1，2，ZHANG Han1，WANG Shao-xia1，2，MIAO Lin1，MAO Hao-ping2，ZHOU Kun2
（1．Tianjin Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Tianjin Key Laboratory of Chinese Medical Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effects of psoralen components，isopsoralen and isobavachalcone on the cultured osteoclasts TRACP enzyme activity and differention.Moreover，the effect of two components on the mice osteoblasts proliferation and differentiation were also studied.［Methods］Using M-CSF and RANKL，osteoclast precursor cells were induced to differentiated into mature osteoclasts.During the differention period，isopsoralen and isobavachalcone were added to cells，therefore PNPP were used to detected osteoclasts TRACP activity.ICC staining of TRACP were performed to identify mature osteoclasts number.The neonatal mice osetoblast cells were cultured in vitro，CCK-8 methods were adopted to detected the osteoblast proliferation properties.Sodium phenylphosphate were used to measure the osteoblast marker enzyme ALP activity.［Results］Mouse osteoclasts and osteoblasts were cultured successfully in vitro.Isobavachalcone significantly inhibit the mature osteoclast formation at the dose of 0.05 μM，and isopsoralen had a significant role in promoting osteoblast proliferation at the dose of 0.1 μM.［Conclusion］Psoralea components isopsoralen and isobavachalcone have effects on bone cells，suggesting that Fructus Psoraleae maybe act as a drug for anti-osteoporosis or anti-bone resorption.

isopsoralen；isobavachalcone；osteoclasts；osteoblast；proliferation；differention

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0299-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.12

國家自然科學青年基金項目（81102860，81202991）。

柴麗娟（1976-），女，博士研究生，助理研究員，主要從事中藥雌激素樣活性防治骨質疏松研究。

（2014-11-29）