金天格膠囊對大鼠長骨干骨折愈合影響的實驗研究*

張蔚然，陸　軍，宋東輝，曾憲帆，王　威，楊　杰（1.天津市公安醫院骨科，天津300042；2.天津市公安醫院足踝外科研究所，天津300042）

金天格膠囊對大鼠長骨干骨折愈合影響的實驗研究*

張蔚然1，2，陸軍1，2，宋東輝1，2，曾憲帆1，2，王威1，2，楊杰1，2
（1.天津市公安醫院骨科，天津300042；2.天津市公安醫院足踝外科研究所，天津300042）

［目的］研究金天格膠囊對大鼠股骨干骨折愈合的影響，以及應用Micro-CT技術對骨折愈合過程中骨內微結構的觀察。［方法］將40只8周齡SD雄性大鼠通過隨機數字表法分為兩組，分別為實驗組和對照組，每組20只。分別建立股骨干閉合骨折髓內釘固定模型，術后第3天始給予相應的干預措施。每組于造模后2周及8周兩個時間點各處死實驗動物10只。對患肢股骨進行取材后，大體觀察骨折愈合情況，通過X線對骨折愈合情況進行評分，利用生物力學實驗機測量骨痂的最大載荷、最大載荷恢復率，利用Micro-CT技術計算骨痂的總體積（TV）、骨體積（BV）及骨體積分數（BV/TV%）并對骨痂進行組織形態學觀察。［結果］術后2周，實驗組和對照組骨折愈合X線評分沒有統計學差異。Micro-CT檢測結果提示，實驗組的TV值高于對照組，但兩者的BV及BV/TV%值沒有統計學差異。兩組骨痂的最大載荷和最大載荷恢復率差異無統計學意義。術后8周，兩組的X線評分、TV值沒有統計學差異。但實驗組的最大載荷、最大載荷恢復率、BV值及BV/TV%值高于對照組，差異有統計學意義。［結論］金天格膠囊可以促進骨折愈合。主要表現在骨折早期它會促進軟骨痂的形成，骨折后期加速骨痂的礦化，提高骨折愈合的力學性能。

中藥；骨折；動物模型；Micro-CT；治療

骨折是指骨的連續性以及完整性被破壞，是骨機械性能超負荷的結果。骨折愈合是一個十分復雜的生物學修復過程。因各種原因導致的骨折延遲愈合和不愈合不僅會增加患者的痛苦還會增加患者的經濟負擔，多數患者還會留有功能障礙。因此，如何促進骨折愈合，縮短骨折愈合時間，減少患者并發癥的發生，是廣大創傷骨科醫生非常關心的問題之一［1-3］。中醫治療骨折有著悠久的歷史，且中藥治療骨折既經濟且療效確切，體現了中藥治療骨折的優勢［4-10］。本研究通過建立大鼠長骨干骨折模型，觀察聯合金天格膠囊及髓內釘治療對骨折愈合的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物8周齡雄性SD大鼠40只（SPF級，天津醫科大學動物實驗中心提供），體質量225～251 g，采用隨機數字表法將其分為兩組，每組20只，分別為實驗組和對照組。飼養于天津醫科大學標準動物實驗中心，標準鼠糧適應性飼養1周，自由飲水，室溫（21±3）℃，間隔12 h照明，定期消毒及通風。實驗符合實動物道德標準，獲得天津市公安醫院倫理委員會批準。

1.2藥物金天格膠囊（由金花集團股份有限公司現金花制藥廠提供，國藥準字Z20030080號，產品批號140319，規格為每粒0.4 g）的復方藥物由人工虎骨粉組成。將中藥顆粒溶于20倍蒸餾水中，放置于加熱攪拌臺上進行充分溶解并濃縮，制成藥物混懸液。

1.3實驗器材5 mL一次性使用無菌注射器針頭（直徑為1 mm，碧迪醫療器械有限公司提供）；金屬骨針（長150 mm，直徑0.8 mm，天津市新中醫療器械有限公司提供）。數字放射成像機（DR）；Endura TEC ELF 3300力學實驗儀器（Bose公司，美國）；Micro-CT成像系統（1172V2型，SKYSCAN公司，比利時）；Leica SM2000R型平推切片機；光學顯微鏡及拍照系統。

1.4實驗方法

1.4.1骨折模型制作方法使用3.5%的水合氯醛（10 mL/g）行腹腔麻醉成功后，常規消毒，取左下肢髕骨外側緣縱行切口，長約1 cm，逐層切開皮膚及部分股四頭肌腱性組織，屈曲膝關節并向內側脫位髕骨，清楚顯露股骨髁間凹。利用一根5 mL注射器針頭（直徑1 mm）在股骨髁間凹處開口，逆行插入克氏針沿髓腔至股骨粗隆間。剪斷多余的克氏針，并將其遠端埋于股骨髁間骨皮質下。碘伏及生理鹽水反復沖洗切口后，使用3-0絲線逐層縫合切口。將動物左下肢外展內旋位固定于造模支架上，通過三點彎曲實驗的原理打擊大腿中部，致股骨中斷橫行骨折。

1.4.2術后處理術后立即在麻醉狀態下拍攝患肢正側位X線片，了解骨折類型及移位程度，要求骨折類型為股骨中段橫行骨折或短斜形骨折，骨折端固定理想無明顯移位，內固定位置理想。造模不合格的大鼠予以剔除，并及時補充樣本量。大鼠單籠飼養，周期定時添足飼料，飲水不加限制，每1～2天更換1次墊料，保持干燥。

1.4.3給藥方法造模成功后第4天始進行相應的藥物治療。通過灌胃方式給藥，給藥劑量經人-大鼠體表面積比值折算成等效劑量［公式為成人每天總量3.6 g×0.07/1.5=0.168 g/（kg·d）］，用蒸餾水配置成相應濃度的藥物混懸液。每只大鼠的給藥容積為1mL，對照組給予等量的蒸餾水，每天1次，持續至標本取材。

1.5觀察項目與方法

1.5.1標本取材于術后第2、8周兩個時間點，兩組各取10只大鼠，過量麻醉處死，取手術側及健側股骨全長標本，剔除附著股骨干的肌肉，取出髓內釘后用濕鹽水紗布包裹置-20℃冰箱中低溫保存。

1.5.2骨痂大體標本觀察取材后肉眼觀察兩組大鼠骨折側股骨的骨痂外形，比較兩組大鼠骨痂形成的情況以及骨折端的穩定程度。

1.5.3X線評分大鼠過量麻醉后立即行股骨全長X線照片，觀察骨折兩端的變化。使用X線機拍攝股骨正位X線片，攝片條件為：電壓40 KV，電流2 mAs，曝光時間4 ms。由兩名研究者獨立使用Goldberg法［11］對骨折愈合進行評分：0=影像學未愈合；1=部分愈合；2=完全愈合。如遇結果不一致，通過請教第三方解決。

1.5.4Micro-CT檢查將樣本置于Micro-CT測試管內，沿標本長軸方向進行掃描，獲取連續的Micro-CT圖像，層間距為26.6 μm，平面圖像分辨率為1024×1024，像素點尺寸為20 μm×20 μm，放射劑量為49 KV，795 uA。圖像高斯慮波后，以骨折部位為中心進行三維重建。利用CTAn分析軟件（SKYSCAN公司，比利時）將得到的三維圖像信息進行分析，將圖像灰度值81定為骨組織與非骨組織的分界線。定義骨折部位上下5 mm范圍內的區域為興趣區（Range of interest，ROI）。通過ROI的建立，計算樣本骨痂的總體積（total callus volume，TV， mm3），骨體積（total bone volume，BV，mm3），骨體積分數（BV/TV，%）。

1.5.5力學測試測試前室溫解凍標本，使用Endura TEC ELF 3200力學實驗儀器進行四點彎曲試驗。頂端跨距為8 mm，底端跨距為20 mm。加載速度為1 mm/min。測量時保持各標本位置一致，并保持標本濕潤狀態。記錄載荷-位移曲線、最大載荷、最大載荷恢復率。

1.5.6組織學觀察取骨折斷端局部組織置于4%多聚甲醛溶液中，4℃下固定48 h。然后，將標本置于硝酸—甲醛脫鈣液中進行脫鈣，直至組織軟化為止。脫鈣后用酒精梯度脫水，使用二甲苯透明處理2 h，石蠟包埋。沿股骨干長軸切片，厚度為5 μm，再行HE染色。隨機取5張股骨切片，分別在光學顯微鏡下觀察骨折的生長情況。

2　結果

2.1骨痂大體標本觀察術后2周，實驗組與對照組的骨折斷端均可見肥大的骨痂形成。骨折端愈合尚穩定，部分標本骨折斷端稍有微動。術后第8周時，兩組標本骨折端骨痂體積均較前變小，骨折愈合穩定，骨折斷端均未見明顯活動。

2.2X線評分2周時，實驗組的X線評分（1.00± 0.57）分與對照組組的X線評分（0.91±0.58）比較差異無統計學意義（t=0.35，P=0.73）。8周時，實驗組的X線評分（1.95±0.30）分與對照組組的X線評分（1.95±0.41）分比較差異也無統計學意義（t=0.61，P= 0.66），見圖1、2。

圖1　術后2周大鼠股骨X線檢查結果Fig.1　The results of X-ray at 2 weeks after fracture

2.3Micro-CT檢查結果術后第2周實驗組的ROI區域的平均總體積（669.05±27.50）mm3大于對照組（639.55±25.30）mm3，組間差異有統計學意義（t=2.81，P=0.02）。而兩者的平均骨體積分別為（50.68±4.53）mm3和（49.38±4.86）mm3，組間無統計學差異（t=0.51，P=0.72）。平均骨體積分數分別為8.21%± 0.51%和8.73%±0.66%，兩組比較無統計學差異（t=1.25，P=0.39）。而術后8周時，實驗組與對照組ROI區域的平均總體積分別為（378.50±30.08）mm3和（388.64±37.90）mm3，兩者沒有統計學差異（t=0.33，P=0.75）。但平均骨體積，實驗組大于對照組，分別為（85.27±4.99）mm3和（71.31±4.86）mm3，兩者差異具有統計學意義（t=2.70，P=0.01）。實驗組的平均骨體積分數（25.20%±0.74%）大于對照組（16.41%±0.91%），且組間差異有統計學意義（t=4.42，P＜0.01），見圖3、4、5。

圖2　術后8周大鼠股骨X線檢查結果Fig.2　The results of X-ray at 8 weeks after fracture

圖3　術后2周大鼠股骨Micro-CT檢查結果Fig.3　The results of Micro-CT at 2 weeks after fracture

圖4　術后8周大鼠股骨Micro-CT檢查結果Fig.4　The results of Micro-CT at 8 weeks after fracture

圖5　術后2、8周大鼠骨痂BV/TV%值的柱狀圖Fig.5　The results of BV/TV%of callus at 2 and 8 weeks after fracture

2.4力學測試結果通過載荷—位移曲線獲得最大載荷。兩組模型骨折后的最大載荷隨時間的延長逐漸增加。術后2周時，實驗組的最大載荷（27.32± 1.10）N與對照組（26.54±0.97）比較沒有統計學差異（t=1.10，P=0.33）。而術后8周時，實驗組的最大載荷（59.96±2.95）N大于對照組（35.23±1.22）N，且差異有統計學意義（t=2.49，P=0.04）。以骨折側股骨最大載荷占對側非骨折側股骨最大載荷比例表示骨折載荷恢復率。結果顯示，術后2周時兩組的最大載荷恢復率比較沒有統計學差異，而術后8周時實驗組的最大載荷恢復率高于對照組，且差異有統計學意義，見圖6、7。

圖6　術后2、8周大鼠股骨抗彎最大載荷力學結果柱狀圖Fig.6　The results of bending maximal load of femur at 2 and 8 weeks after fracture

2.5組織學觀察術后2周時，實驗組的骨折端有較多的纖維性和軟骨性骨痂，并在軟骨痂邊緣見到鈣化，可見骨外膜下成骨。同時，大量骨小梁開始形成，骨小梁間隙內可見豐富的毛細血管。對照組的骨折端亦有較多纖維骨痂和軟骨痂形成，但間隙較大，結構疏松。術后8周時，實驗組見部分軟骨骨痂被骨性骨痂替代，部分成熟的骨小梁，礦化更加明顯，小梁與應力方向一致，排列有序。對照組骨小梁方向性不明顯，成骨不夠活躍，骨小梁增粗不及實驗組明顯，見圖8。

圖7　術后2、8周大鼠股骨抗彎最大載荷恢復率結果柱狀圖Fig.7　The results of bending maximal load recovery rate of femur at 2 and 8 weeks after fracture

圖8　骨痂HE染色結果Fig.8　HE staining of callus

3　討論

3.1金天格膠囊的特點［12］虎骨是貓科動物虎的骨骼，在傳統中醫藥中以虎骨入藥具有悠久歷史，其功效主要是祛風止痛和強筋骨，可以很好緩解骨質疏松癥所出現的腰酸背痛，膝軟無力，步履艱難等癥狀，從而在一定程度上減少了骨質疏松癥所帶來的骨折隱患。目前虎的數量已非常稀少，處于瀕臨滅絕的危險，各國政府都制定了相關的法律保護，嚴禁虎制品買賣和入藥，中國已于1993年5月將虎骨從《中國藥典》中刪除。但虎骨入藥的療效歷來都獲得肯定，為了滿足傳統中醫藥治療疾病的需要，尋找虎骨的良好替代品已成為臨床上需要迫切解決的問題。金天格膠囊的原料藥又稱為人工虎骨，是由國家衛生部立項研發的課題，由中國藥品生物制品檢定所利用仿生學原理研制成功，其所含成份與天然虎骨基本相同。

3.2金天格膠囊對骨折愈合的影響本研究在大鼠長骨干骨折模型的基礎上，使用金天格膠囊對骨折大鼠給予干預，觀察該方對骨折愈合的影響。本研究分別從生物力學、骨痂顯微結構、骨影像學以及組織形態學水平對骨折愈合進行了評價。結果顯示，在骨折早期口服金天格膠囊可以使骨折端的軟骨痂增大，晚期可增加骨痂的礦化水平，促進了骨痂生物力學性能的提高。

研究結果提示，金天格膠囊對骨折愈合有很好的促進作用［13］，其機制為金天格膠囊是天然虎骨粉的代用品，屬國家一類新藥，其原料藥來自動物骨骼，含豐富的骨膠原蛋白，是參與骨形成的重要有機基質；人工虎骨粉不但能增加血鈣水平，增加骨密度，提高骨強度及韌性，也能減少骨吸收，其抗骨質疏松機制可能與其含有高量鈣，具有直接補鈣的作用有關［14-15］。同時有研究顯示金天格膠囊可改善大鼠骨內微結構，可能通過提高堿性磷酸酶活性，降低耐酒石酸酸性磷酸酶活性，增加骨密度，具有促進骨形成抑制骨吸收的功效，且與天然虎骨的作用相近［16-17］。

從骨折愈合后期的生物力學性能評價以及骨折礦化程度分析，該方劑能加速骨折大鼠骨痂的礦化以及骨折愈合時間，明顯改善骨折部位的生物力學性能，對骨痂內鈣鹽的沉積有促進作用。可能由于虎骨能促進成骨細胞、破骨細胞堿性磷酸酶和酸性磷酸酶的合成與釋放，促進骨折斷端鈣磷的沉積，促進骨痂的礦化［16］。

3.3本研究的優勢和局限性在本研究中，從傳統X線評分角度觀察骨折愈合，顯示是否給予金天格膠囊對于骨折愈合沒有明顯差異。但本實驗通過Micro-CT技術重建了大鼠骨折端骨痂的數字化三維圖像，并進行定量分析，得到了骨痂的相關形態學參數。在離體空間更精確地反應了骨痂形態和骨痂礦化的過程，明確了給予金天格膠囊在骨折早期和后期對骨折愈合的不同影響。同時，也體現了Micro-CT技術可以作為一種新的手段對骨折愈合進行評價的優勢［18］。

本研究的局限性在于：骨折愈合是一個動態的過程，骨的重塑過程持續很久。本研究選擇的時間點為兩個，僅反映了藥物對骨折早晚期的作用效果，尚不能明確該藥物的遠期療效。該藥物對骨折愈合影響的具體機制尚需進一步的研究。由于樣本量有限，可能影響本研究結果的穩定性。

4　結論

金天格膠囊在大鼠骨折愈合早期，可以促進血腫機化及軟骨痂的形成，在大鼠骨折愈合晚期可以加速骨痂的礦化并提高骨痂的生物力學性能，最終促進骨折的愈合。由此可見，金天格膠囊有很好的促進骨折愈合的效果，但在骨折不同時期，應用該方劑對骨折愈合影響的表現不同。

［1］任守平，張榮位.接骨活血膏促進骨折愈合83例的療效觀察［J］.天津中醫藥，2011，28（5）:432.

［2］鄭昆侖，谷福順.兩種微創手術治療股骨頸骨折的療效觀察［J］.天津中醫藥，2008，25（3）:254.

［3］任守平，金鴻賓.骨樂寧膠囊早期促進骨折愈合作用的臨床研究［J］.天津中醫藥，2010，27（4）:283-285.

［4］劉鐘華，楊世榮，回春.中藥促進骨折愈合的實驗研究概況［J］.長春中醫學院學報，2004（02）:63-65.

［5］宓士軍，高萬旭，周廣軍，等.復方接骨膠囊對胸腰椎骨質疏松骨折椎體成形術后的影響［J］.中華中醫藥雜志，2009（10）:1355-1357.

［6］任守平，張榮位，金鴻賓.骨樂寧膠囊對大鼠骨折模型VEGF的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2011，30（3）:163-164.

［7］劉艷偉，劉紹輝，于雪峰.中西醫結合治療股骨髁骨折27例［J］.天津中醫藥大學學報，2009，28（4）:215-216.

［8］谷福順，時玨.股骨粗隆間骨折的治療進展［J］.天津中醫藥大學學報，2006，25（2）:107-108.

［9］李志良.手法復位、外固定治療兒童移位肱骨髁上骨折45例［J］.天津中醫藥大學學報，2008，27（2）:93.

［10］王平，趙雪圓.探究式教學法在中醫骨傷科學教學中的應用研究［J］.天津中醫藥大學學報，2007，26（3）:154-155.

［11］Goldberg V M，Powell A，Shaffer J W，Zika J，Bos G D，Heiple K G. Bone grafting:role of histocompatibility in transplantation［J］.J Orthop Res，1985，3（4）:389-404.

［12］趙冀偉.金天格膠囊治療骨質疏松性骨折50例臨床研究［J］.中國骨質疏松雜志，2012，18（1）:63-65.

［13］吳官保，徐無忌，楊彬.金天格膠囊對骨質疏松性肱骨外科頸骨折愈合的影響［J］.中國骨質疏松雜志，2011，17（1）:64-66.

［14］程棟，龍攀，周海艇，等.中醫藥治療骨質疏松癥研究近況［J］.中國骨質疏松雜志，2003，9（1）:86-89.

［15］劉維嘉，麥敏軍，劉永坤.中醫藥治療原發性骨質疏松癥的研究近況［J］.中國骨質疏松雜志，2009，15（5）:374-376.

［16］姜波，聞輝，楊春輝.金天格膠囊治療原發性骨質疏松癥的臨床療效［J］.中國社區醫師（醫學專業），2010，12（35）:123.

［17］張軍，吳林生，孫樹椿，等.金天格膠囊治療原發性骨質疏松癥660例臨床療效［J］.中國骨質疏松雜志，2005，11（4）:490-495.

［18］Vasquez S X，Shah N，Hoberman A M.Small animal imaging and examination by micro-CT［J］.Methods Mol Biol，2013，947:223-231.

（本文編輯：馬英，張震之）

Effects of Jintiange capsules in treating fracture healing and in microstructure of bone in rats

ZHANG Wei-ran1，2，LU Jun1，2，SONG Dong-hui1，2，ZENG Xian-fan1，2，WANG Wei1，2，YANG Jie1，2
（1.Orthopedic Department，Tianjin Gong’an Hospital，Tianjin 300042，China；2.Foot and Ankle Institute，Tianjin Gong’an Hospital，Tianjin 300042，China）

［Objective］To evaluate the effects of Jintiange capsule in treating fracture healing in rats.［Methods］The 40 Spragu-Dawley rats were divided into two groups randomly.Left femoral shaft fractures were created in all rats closely，and treated with intramedullary nail.The rats of experimental group were administrated with Jintiange capsule.The rats of control group were given water.The rats were sacrificed at 2 and 8 weeks.Parameters of callus in two groups were evaluated by Micro-CT.Endura TEC ELF 3200 mechanical testing machine was used to evaluate the biomechanical effect of fractured femoral shaft.Moreover，the fracture healing was also evaluated by X-ray.［Results］At 2 and 8 weeks，there was no significant difference in fracture healing evaluated by X-ray between two groups.The total volume（TV）in callus in experimental group was higher than control group in 2 weeks，but no difference in bone volume（BV），BV/TV and biomechanical property.At 8 weeks，the experimental group was significant in BV，BV/TV and biomechanical property compared with control group，but not in TV.［Conclusion］Jintiange capsule can enhance the fracture healing in rats by increasing callus formation in early phase and improving mineralization in later phase.

traditional Chinese medicine；fracture；animal model；Micro-CT；treatment

R683.4

A

1672-1519（2015）05-0286-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.09

天津市公安局科技基金項目（2013KYSGAY033）。

張蔚然（1979-），男，醫師，研究方向為創傷骨科、關節、脊柱矯形等。

陸軍，E-mail:junlu0419@163.com。

（2014-12-20）