高通量測序分析膽囊結石患者microRNA表達譜差異

楊斌，張捷，劉斌，吳韜，王強

高通量測序分析膽囊結石患者microRNA表達譜差異

楊斌1，張捷2Δ，劉斌1，吳韜1，王強1

目的 探討膽囊結石和非結石患者膽囊黏膜中miRNA表達譜的差異。方法 選取30例膽結石患者（結石組）和30例膽囊息肉患者（非結石組）的膽囊黏膜組織，采用Illumina HiSeq 2500高通量測序技術進行深度測序，比較2組的microRNA表達差異。對差異表達的miRNAs進行篩選與靶基因預測，并進行GO和KEGG功能顯著性富集分析。熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）對差異表達miRNAs進行驗證。結果 結石組和非結石組分別獲得2 215 832和1 424 770條序列，平均長度22 nt。2組間顯著差異表達的miRNA共計17個，其中9個表達上調，8個表達下調。GO分析結果示靶基因富集于離子的結合和轉運、載脂蛋白結合、鈣離子通道激活、蛋白激酶活性等分子功能以及大分子的合成和代謝、類固醇激素生物合成和代謝等生物進程。KEGG通路富集分析示靶基因多集中于癌癥相關通路，包括WNT、Hippo等信號通路。qRT-PCR結果示差異性miRNA的表達趨勢與測序結果相一致。結論 差異表達的miRNA可能在膽囊結石的形成中具有重要作用。

微RNAs；基因表達譜；序列分析；膽囊結石病；差異表達；高通量測序；生物信息學

膽囊結石（GS）是臨床常見的消化系統疾病，患病人數逐年增加，各個年齡段均可發病。MicroR?NAs（miRNAs）是一類長度為約為22 nt的非編碼RNA，廣泛分布在病毒、植物及高等哺乳動物中［1］，作為一種重要的轉錄后調控方式，miRNAs參與了人類近1/3的基因表達過程，在多種疾病的發生發展中起到了重要的調節作用［2-3］。研究發現多種疾病中均存在miRNAs的差異表達［4］。但有關膽囊結石中miRNAs差異表達的研究較少，基于此，本研究利用高通量測序技術對膽囊結石患者組織中差異表達的miRNAs進行分析，為膽囊結石臨床治療提供可能的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月—2013年12月昆明醫科大學第一附屬醫院肝膽外科收治的30例膽結石患者膽囊黏膜組織（結石組），以同期收集的30例膽囊息肉患者膽囊黏膜組織（非結石組）做為對照。其中每組隨機取10例進行高通量測序，全部標本均用于PCR驗證。結石組男13例，女17例，年齡29～70歲，中位年齡43歲。非結石組男14例，女16例，年齡24～65歲，中位年齡46歲，均為腺瘤性息肉。排除病毒性肝炎、糖尿病及代謝性疾病、近3個月內膽囊炎急性發作及使用抗生素者。本研究經昆明醫科大學倫理委員會批準并得到患者的知情同意。

1.2 主要試劑 Trizol試劑（Invitrogen，美國），Dnase I（Qia? gen，德國），SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR（Takara，日本），Small RNA Smaple Prep文庫構建試劑盒（Illumina，美國）。

1.3 樣本總RNA提取及分離 Trizol法提取標本總RNA， Dnase I處理RNA以消除DNA污染，所有步驟嚴格按照說明書進行操作。采用微量核酸蛋白測定儀（Agilent公司）、甲醛變性凝膠電泳和毛細管電泳對提取的總RNA進行質檢，確保總RNA的濃度及完整性達到測序要求。

1.4 測序文庫的構建及測序 每例樣本取1.5 μg總RNA行15%尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后對18～32 nt片段進行切割、洗脫、純化回收。采用Illumina公司的Small RNA Sample Prep Kit構建小RNA文庫。純化后的小RNA序列采用T4 RNA連接酶將接頭引物分別連接至兩個文庫的序列5′端和3′端，逆轉錄合成cDNA第一鏈，PCR建立小RNA文庫。利用Illumina HiSeq 2500測序平臺對該文庫進行高通量測序。

1.5 小RNA數據處理和信息分析 測序所得長度為51 nt的小RNA序列通過去接頭、去除低質量和污染序列，最終獲得18～32 nt的高質量小RNA序列。統計小RNA的種類、數量及長度分布，初步判斷小RNA質量。采用mirdeep2軟件將所得小RNA序列與參考基因組進行比對分析，再將匹配序列分別與GenBank和Rfam 10.0數據庫進行對比，篩選出miRNA序列并分類注釋，分析其表達情況。

1.6 miRNA差異表達分析 將樣本中的miRNA表達量標準化為TPM（Tags per million），應用EdgeR軟件對2組樣本已知miRNA表達差異分析統計。將“差異倍數”絕對值≥2 且P＜0.05的miRNA定義差異表達的miRNA。差異倍數= log2（結石組miRNA標準化的表達量/非結石組miRNA標準化的表達量）。

1.7 GO和KEGG顯著性富集分析 首先利用miRanda-3.3a對表達差異的miRNA進行靶基因預測，選取所預測的靶基因中能量值最低的10個基因。將所預測的靶基因映射到Gene Ontology（GO）數據庫中的各個條目中，計算映射到各條目的基因數，利用超幾何分布計算得到P值。滿足P≤0.05即為差異表達miRNA的靶基因中顯著性富集的GO條目。同時利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge?nomes）數據庫，將差異miRNA的靶基因進行映射，采用與GO相同的計算方法獲得KEGG分析結果。

1.8 差異表達miRNA的驗證 應用實時熒光定量PCR （qRT-PCR）對4個顯著性差異表達的miRNA進行檢測，驗證高通量測序結果的可信性。rRNA U6作為內參，miRNA檢測用上游特異性引物由蘇州金唯智公司合成，下游通用引物為試劑盒中特有。上游引物序列miR-192-5p：5′-GACCTAT?GAATTGACAGC-3′；miR-194-5p：5′-ACAGCAACTCCATGT?GG-3′；miR-133a-5p：5′-TTTGGTCCCCTTCAACC-3′；miR-146b-5p：5′-GAGAACTGAATTCCATAGG-3′。擴增條件：95℃10 min；95℃10 s，60℃退火延伸30 s，40個循環。PCR結果采用2-ΔΔCt法計算相對表達值。實驗在Roche LightCycler 480重復運行3次。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各樣本序列分析及組成分布 原始序列經過處理后，2組樣本所獲得的可用于分析的小RNA序列數量分別為2 215 832和1 424 770條。所獲得的序列長度主要集中于18～22 nt，說明測序獲得的序列質量較高，見圖1。可以用于后續的生物信息學分析。

Fig.1 Size distribution of sequenced small RNAs betwen 18-32 nt圖1 樣本中小RNA在18～32 nt范圍內的長度分布

2.2 差異性表達miRNAs的分析 見表1。結石組共獲得760個miRNAs成熟體序列，非結石組獲得668個miRNAs成熟體序列。2組587種miRNAs共同表達，進一步分析結果顯示17個miRNAs呈顯著性差異表達。在差異性表達的miRNAs中，9種miRNAs表達上調，8種miRNAs表達下調。

Tab.1 Differentially expressed miRNAs表1 差異表達的miRNAs

2.3 GO和KEGG功能顯著性富集分析 GO的3個本體分別描述了基因的生物學過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組分（cellular component，CC）。GO分析結果示樣本在富集的分子功能上多集中于離子的結合和轉運、載脂蛋白結合、鈣離子通道激活、蛋白激酶活性等；在細胞進程上多富集于大分子的合成和代謝，類固醇激素生物合成和代謝過程等，見表2。KEGG通路富集分析示，受miRNAs調控的靶基因參與了36條信號通路，這些通路中多集中于癌癥相關通路，包括Basal cell carcinoma、WNT、Hippo等信號通路，見表3。

Tab.2 GO analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表2 差異miRNAs的靶基因GO功能富集分析

2.4 qRT-PCR驗證 采用qRT-PCR對2個上調表達的miRNAs（miR-192-5p和miR-194-5p）和2個下調表達的 miRNAs（miR-133a-5p和 miR-146b-5p）進行驗證。結果顯示4個miRNA的表達變化趨勢與高通量測序的結果基本一致（t值分別為46.354、104.623、26.284、84.434，均P＜0.05），進一步證實了高通量測序結果的準確性，見圖2。

Tab.3 KEGG analysis of targets genes of differential expressed miRNAs表3 差異miRNAs的靶基因KEGG功能富集分析

Fig.2 The expression ratio of differential miRNAs in two groups圖2 2組樣本中的miRNAs相對表達水平差異

3 討論

本研究通過高通量測序技術結合生物信息學方法，找出膽囊結石中差異表達的miRNA及可能的靶基因，將靶基因進行功能分類，進一步推測miRNA在膽囊結石中的功能和作用。研究發現了膽囊結石組樣本中呈顯著性差異表達的17個miRNAs，其中9種miRNAs表達水平上調，8種miRNA分子表達水平下調。qRT-PCR的結果也證實了與高通量測序結果相一致的miRNA表達變化。

本研究獲得的差異表達miRNA的靶基因在GO富集的分子功能上多集中于離子的結合和轉運，在細胞進程上多富集于大分子的合成和代謝，這也符合結石病的預期。Lammert等［5］在2001年提出了45條膽石病侯選基因，它們主要是脂類代謝相關蛋白及膽囊相關蛋白。本研究獲得的miRNA預測的靶基因基本上能涵蓋這45條候選基因，間接證明了測序結果的可靠性。

膽囊結石的發生發展是個復雜的過程，涉及到多種信號通路，對任一通路的調控都可能對治療膽囊結石起到重要作用。本研究中顯著差異表達的部分miRNAs已被證實參與膽囊癌的調控，如miR-200與ZEB基因形成一個反饋通路進而參與膽囊癌的發展進程［6］。miR-146能夠改變程序性細胞死亡4（PDCD4）的表達，促進膽囊上皮的轉化［7-8］。miR-34也被證實可能會調控腫瘤干細胞端粒酶長度，進而影響膽囊癌患者的預后［9］。盡管尚無miRNAs和膽囊結石發生、發展關系的報道，但是從miRNA調控一些相關基因的研究中可間接發現其與膽囊結石的關聯性。如miR-145和miR-199a可以直接靶向調控黏蛋白-1（mucin-1）［10-11］；miR-200c和miR-150靶向調控mucin-4［12］。筆者前期的工作或是已經報道的研究均顯示，mucin蛋白均與膽囊結石聯系緊密［13］。因此，本研究中篩選到的miRNAs可能通過某種或多種信號通路影響膽囊結石甚至膽囊癌的發生發展［14］。高通量測序技術的迅猛發展，使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致的全貌分析成為可能。本研究通過高通量測序技術成功篩選到一些與膽囊結石相關的差異表達的miRNAs，為膽囊結石成因的研究提供了新的思路和工作基礎。

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（2014-11-24收稿 2014-12-30修回）

（本文編輯 胡小寧）

Analysis of differential microRNA expression in patient with gallbladder stones through high-throughput sequencing technologies

YANG Bin1，ZHANG Jie2Δ，LIU Bin1，WU Tao1，WANG Qiang1
1 Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China；
2 Department of hepatobiliary surgery，The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University
△Corresponding Author E-mail：jason6677@hotmail.com

Objective To detect the differential expression profile of microRNAs between patients with or without gall?bladder stone.Methods Samples from 30 patients with gallbladder stones（GS）and 30 without gallbladder stones（GP）were collected，in which microRNAs expression profiles were examined using high-throughput sequencing instrument Illumi?na HiSeq 2500.MicroRNA sequences were obtained and compared to Genebank and Rfam database for classification.Differ?entially expressed microRNAs were screened，and their target genes were predicted.Significant enrichment analysis of GO and KEGG were performed.Real-time quantitative PCR was performed on selected miRNAs in order to validate their expres?sion.Results Clean tags were obtained from both GS group（n=2 215 832）and GP group（n=1 424 770）.A total of 17 mi?croRNAs were differentially expressed between GS and GP groups with statistical significance，among which 9 were up-regu?lated and 8 were down-regulated in GS group compared to those in GP group.GO（Gene ocology）analysis showed that target genes were enriched in ion binding and transport，apolipoprotein binding，calcium channel activity，protein kinase activity，steroid hormone biosynthesis and metabolism.KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）analysis is shown for the target genes enriched in cancer related pathways，including WNT，HIPPO pathways.qRT-PCR validation of some differen?tially expressed miRNAs confirmed the result of high-throughput data analysis.Conclusion The differential expression levels of microRNAs may play an important role in occurrence and development of gallbladder stones.

microRNA；gene expression profiling；sequence analysis；cholecystolithiasis；differential expression；highthrough sequencing；bioinformation

R657.4+2，R318.04

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.04.004

云南省應用基礎研究計劃重點項目（2006C008Z）

1昆明醫科大學第一附屬醫院肝膽外科（郵編650032）；2昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽外科

楊斌（1981），主治醫師，碩士，主要從事肝膽胰疾病的防治研究

E-mail:jason6677@hotmail.com