Six1在宮頸癌組織中的表達及意義

王彤，樸龍鎮，崔雪蓮，楊洋，南云澤△

Six1在宮頸癌組織中的表達及意義

王彤1，樸龍鎮1，崔雪蓮2，楊洋2，南云澤1△

目的探討Six1基因在宮頸癌組織中的表達情況及其臨床意義。方法免疫組織化學SP法檢測123例宮頸癌組織，49例宮頸上皮內瘤變（CIN）組織及32例正常宮頸組織中Six1蛋白的表達。體外培養人宮頸癌HeLa細胞，免疫熒光染色觀察Six1蛋白在細胞中的定位。結果宮頸癌組織Six1蛋白陽性表達率（72.3%）高于CIN （28.6%）及正常宮頸組織（15.6%），χ2分別為13.118，10.058（均P＜0.01）。不同腫瘤大小，淋巴結及血道轉移情況的宮頸癌組織中Six1蛋白陽性表達率差異有統計學意義（均P＜0.01）。Six1蛋白在HeLa細胞中主要定位于細胞漿和核仁。結論Six1與宮頸癌的發生發展密切相關，可能成為宮頸癌的侵襲與轉移的分子標志物。

宮頸腫瘤；基因，同源盒；Six1；免疫組織化學；腫瘤浸潤；腫瘤轉移；HeLa細胞

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康。惡性腫瘤的侵襲與轉移在不同程度上影響著癌癥的進展，其中腫瘤新生血管與逃避免疫系統的識別與破壞有重要意義，轉移過程中的“信號轉導”已成為腫瘤學領域的研究熱點。同源盒基因家族中Six1基因在細胞增殖、分化過程中具有重要的作用，并且在多種惡性腫瘤組織中異常表達［1］。但有關宮頸癌中Six1表達的研究較少，本文旨在通過比較Six1蛋白在不同宮頸組織中的表達情況，探討其在宮頸癌侵襲轉移中的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象123例宮頸癌組織芯片購自上海芯超公司，包括107例宮頸鱗癌、16例宮頸腺癌。49例宮頸上皮內瘤變（CIN）組織與32例正常宮頸組織取自延邊大學腫瘤研究中心。123例患者年齡34～66歲，中位年齡52歲，＜55歲者64例，≥55歲者59例。腫瘤直徑＜3 cm 71例，≥3 cm 52例。依據國際婦產科協會（FIGO）分期標準：早期Ⅰ～ⅡA期76例，晚期ⅡB～Ⅳ期47例。淋巴結轉移69例，無淋巴結轉移54例。血道轉移106例，無血道轉移17例。CIN及正常宮頸組織制成石蠟切片并HE染色，已由病理學專家確診。

1.2細胞及試劑人宮頸癌HeLa細胞購自上海通派生物科技有限公司，常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中。SP免疫組化試劑盒購自丹麥Dako，牛血清白蛋白（BSA）購自北京索萊寶，兔抗人Six1抗體購自Sigma，羊抗兔IgG購自Invitrogen，熒光染料49-6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）及抗熒光淬滅封片液購自碧云天生物技術公司。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學檢測所有標本釆用SP法進行免疫組化染色。操作步驟參照試劑說明書進行。為保證檢測的特異性，分別應用抗兔IgG和PBS代替一抗作為對照。

1.3.2判斷標準Six1蛋白陽性染色呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞漿和核仁。根據陽性細胞數的比例將染色結果分為3級。0級（陰性）：陽性細胞數為0～5%；1級（陽性）：陽性細胞數為6%～50%；2級（強陽性）：陽性細胞數50%以上。計算1級和2級陽性染色病例占總病例數的百分數。

1.3.3免疫熒光染色取24 mm×24 mm蓋玻片，泡酸過夜，純水洗滌，乙醇浸泡過夜、晾干，放入培養皿。取HeLa細胞接種于培養皿中常規培養。待細胞生長至70%融合時，取出玻片，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton-X 100破膜10 min，3%BSA室溫封閉1 h。PBS沖洗后，兔抗人 Six1抗體（1∶100）4℃孵育過夜，次日用羊抗兔 IgG （1∶1 000）常溫孵育1 h，PBS沖洗后DAPI核染細胞。封片液封片后激光共聚焦顯微鏡觀察Six1在細胞中定位。

1.4統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件處理數據，計數資料以例（%）表示，應用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組化結果Six1陽性染色主要位于胞漿與核仁，呈棕黃色顆粒，見圖1。宮頸癌組織中Six1蛋白陽性表達率為72.3%（89/123），CIN及正常子宮上皮組織中Six1蛋白陽性表達率分別為28.6%（14/ 49）和15.6%（5/32）。宮頸癌組織Six1蛋白陽性表達率高于CIN組織及正常宮頸組織（χ2分別為13.118和10.058，均P＜0.01）。CIN組與正常宮頸組比較，差異無統計學意義（χ2=2.295，P＞0.05）。

2.2宮頸癌組織中Six1的表達與臨床病理特征的關系Six1在不同腫瘤大小、淋巴結轉移及血道轉移情況間表達差異有統計學意義（均P＜0.01），而在不同年齡、腫瘤分化程度以及臨床分期間差異無統計學意義，見表1。

Tab.1　Correlations of Six1 protein expression and the clinicopathological features in patients with cervical cancer表1　Six1蛋白在宮頸癌中的表達與臨床病理參數之間的關系　例（%）

2.3免疫熒光染色HeLa細胞中Six1蛋白主要定位于細胞漿和核仁，與免疫組化結果相一致，見圖2。

3　討論

Fig.1　Expression of Six1 protein in different cervical tissues（×200）圖1　Six1蛋白在不同宮頸組織中表達（×200）

腫瘤的浸潤與轉移是導致死亡的主要原因，早期發現腫瘤的侵襲與轉移傾向將有利于患者的治療及預后。腫瘤發生的分子生物學基礎包括細胞生長與增殖的調控與細胞周期的調控，原癌基因與癌基因及其產物（生長因子，信號轉導蛋白與細胞周期調節蛋白等）。同源盒基因是控制機體發育的主要基因，對胚胎器官的發生和細胞分化調控起關鍵性作用［2］。根據同源盒結構域的差異及基序的不同，將同源盒基因分為Hox、Msx、Pax、Lim、Six等幾個家族，其中對Six1的研究較為廣泛。Six1定位在染色體14q23，Six1蛋白在胚胎發生發育過程中主要促進細胞增生、組織分化［3］。

Fig.2　Expression of Six1 protein in HeLa cells（×400）圖2　Six1蛋白在宮頸癌HeLa細胞中表達（×400）

既往研究表明Six1參與了多種腫瘤的發生發展。Coletta等［4］發現乳腺組織中Six1高表達可導致乳腺細胞惡變、轉移。Behbakht等［5］發現卵巢癌中高表達Six1，且Six1表達水平與卵巢癌患者的短期生存率相關。在肝癌和胰腺癌組織中也有類似報道［6-7］。Wan等［8］通過人乳頭瘤病毒（HPV）誘導正常宮頸細胞癌變的過程中發現Six1存在過表達，推測Six1是宮頸癌發展的潛在分子標志物。Xu等［9］發現Six1過表達可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑促進宮頸上皮-間質轉化（EMT）。本研究發現宮頸癌組織中Six1蛋白陽性表達率明顯高于CIN及正常宮頸組織，提示Six1蛋白可能參與了宮頸癌的發生發展，與Tan［10］的研究結果相一致。Six1蛋白在不同腫瘤大小、淋巴結、血道轉移情況的宮頸癌組織中陽性表達率存在差異，提示Six1蛋白的過表達可能與宮頸癌的侵襲與轉移相關，但不同臨床分期間Six1陽性率差異無統計學意義。免疫熒光染色進一步證實了Six1蛋白在宮頸癌細胞中主要定位于細胞漿和核仁。

Six1蛋白的高表達可能參與了宮頸癌的發生發展過程，有望成為宮頸癌侵襲與轉移的分子標志物。本研究的結論與Six1蛋白與其他腫瘤的關系類似，追溯其生物學功能，推測Six1基因通過參與胚胎細胞的發育與分化，調控細胞周期，期間與相應的不同分子或基因共同作用，導致細胞周期的調節異常，進而致其過表達，誘發腫瘤發生。其具體作用機制仍需深入研究與探討。

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（2014-10-20收稿2014-12-30修回）

（本文編輯胡小寧）

Expression and significance of Six1 in cervical cancer

WANG Tong1，PIAO Longzhen1，CUI Xuelian2，YANG Yang2，NAN Yunze1△
1 Department of Gynecology，Yanbian University Hospital，Yanji 133000，China；2 Department of Pathology，Yanbian University Medical College
△Corresponding AuthorE-mail:yznan@ybu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the clinical significance of protein expression of Six1 in cervical cancer.MethodsThe immunohistochemical（IHC）staining was applied to detect the expression of Six1 protein in normal cervical tissues（n=32），cervical intraepithelial neoplasia（CIN）tissues（n=49）and cervical cancer tissues（n=123）.The localization of Six1 protein was detected in vitro cultured HeLa cells using immunofluorescence（IF）staining.ResultsThe positive rate of Six1was significantly higher in cervical cancer（72.3%）than that of CIN tissues（28.6%）and normal cervical tissues（15.6%，χ2=13.118 and 10.058 respectively，P＜0.01）.There were significance differences in expression levels of Six1 protein between different tumor sizes and metastasis of cervical cancer（P＜0.01）.The Six1 protein showed positive signals in cytoplasm and nucleoli in HeLa cells.ConclusionSix1 expression is associated with cervical cancer，which may be a potential biomarker for invasion and metastasis of cervical cancer.

uterine cervical neoplasms；genes，homeobox；Six1；immunohistochemistry；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis；HeLa cells

R737.33

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.007

國家自然科學基金（61371067）；吉林省科技廳中青年科研創新團隊領軍人才項目（20130521017JH）

1延邊大學附屬醫院婦科（郵編133000）；2延邊大學醫學院病理學教研室

王彤（1987），女，醫師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面研究

△E-mail:yznan@ybu.edu.cn