ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性的關(guān)系

郝娥娥，關(guān)鍵，許西琳，高巖，張中宏，王莎莎，王珊

ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與新疆維吾爾族COPD易感性的關(guān)系

郝娥娥，關(guān)鍵△，許西琳，高巖，張中宏，王莎莎，王珊

目的探討ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與中國新疆維吾爾族慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者易感性的關(guān)系。方法收集217例COPD患者（病例組）和218例健康對(duì)照者（對(duì)照組）外周血標(biāo)本，提取標(biāo)本DNA，采用美國生物應(yīng)用系統(tǒng)公司（ABI）SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè)ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果病例組和對(duì)照組S1位點(diǎn)CC、CT、TT 3種基因型分布和C、T等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；S2位點(diǎn)CC、CG、GG 3種基因型分布和C、G等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組S1、S2位點(diǎn)基因型與肺功能相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系顯示：S1、S2位點(diǎn)3種基因型第1秒用力呼氣容積（FEV1）預(yù)計(jì)值（%）比較、FEV1/用力肺活量（FVC）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單體型分析結(jié)果顯示3種單體型在病例組和對(duì)照組中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)SNPs與新疆維吾爾族人群COPD患者易感性無明顯相關(guān)性。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白質(zhì)類；多態(tài)性，單核苷酸；維吾爾族；ADAM 33基因

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以氣流受限為特征的疾病，氣流受限不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)；目前COPD的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，環(huán)境方面吸煙是COPD發(fā)生、發(fā)展最重要的危險(xiǎn)因素。然而，并不是所有COPD患者都是由吸煙引起的，這表明遺傳因素在COPD的發(fā)病機(jī)制中也起一定作用。研究發(fā)現(xiàn)解整合素-金屬蛋白酶33 （ADAM33）基因是哮喘和氣道高反應(yīng)性（AHR）的易感基因［1］。隨后研究發(fā)現(xiàn)該基因與肺功能下降也具有相關(guān)性；而氣道高反應(yīng)性與肺功能下降是COPD病程發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［2］。近期已有研究發(fā)現(xiàn)ADAM 33基因與COPD存在一定的相關(guān)性［3］。ADAM 33基因與COPD的相關(guān)性研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)。本研究旨在探討ADAM 33基因S1、S2位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）與新疆維吾爾族人群COPD易感性及肺功能下降的關(guān)系，從分子水平研究遺傳因素在新疆維吾爾族人群COPD發(fā)病中的作用。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象病例組選自2013年1月—2014年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院、石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院、伊犁州新華醫(yī)院、沙灣縣人民醫(yī)院呼吸科住院及門診COPD患者，所有COPD診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013年修訂版）》。COPD肺功能診斷標(biāo)準(zhǔn)：第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%。經(jīng)過詳細(xì)詢問病史及體格檢查，并進(jìn)行胸部X線檢查和肺功能測(cè)定，共納入217例COPD患者；同期選取218例健康體檢者作為對(duì)照組。2組間性別、年齡、吸煙史、吸煙指數(shù)、體質(zhì)指數(shù)（BMI）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)EV1預(yù)計(jì)值（%）、FEV1/ FVC（%）比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。排除支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病、心血管疾病、肺癌等病史。所有收集資料人員進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)，入選對(duì)象均簽署知情同意書。

Tab.1　Basic information of two groups表1　病例組和對(duì)照組的基本資料

1.2方法

1.2.1DNA提取所有入選對(duì)象采外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，采用TIANGEN生化科技有限公司提供的全血基因組DNA提取試劑盒（非離心柱型）提取DNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2ADAM3基因S1、S2位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) （1）引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank提供的基因序列，使用Primer 3軟件設(shè)計(jì)引物，S1、S2位點(diǎn)在基因上位置臨近共用1對(duì)引物序列，F(xiàn)：5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′；R：5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′，擴(kuò)增片段長度為365 bp。采用SNaPshot分型方法進(jìn)行分型：對(duì)分型結(jié)果進(jìn)行雙盲樣本質(zhì)控和陰性對(duì)照質(zhì)控；SNaPshot反應(yīng)過程中SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物序列：S1位點(diǎn)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTGCTGGCCATGCTCCTCAGC；S2位點(diǎn) TTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTGCTGCCTCTGCTCCCAGG。（2）PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（10 μL）包含10×HotStarTaq buffer 1 μL，25 mmol/L Mg2+0.6 μL，2.5 mmol/L dNTP1.2 μL，5 U/μL Hot-StarTaq polymerase（Qiagen Inc）0.2 μL，1 μL樣本DNA和1 μL多重PCR引物（上下游引物各0.5 μL），5 μL超純水。多重PCR反應(yīng)采用Touch-down PCR反應(yīng)程序：95℃變性2 min；94℃變性20 s，65℃退火40 s，每個(gè)循環(huán)下降0.5℃，72℃延伸1.5 min，11個(gè)循環(huán)。然后94℃變性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，24個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸2 min。結(jié)束后4℃保存。PCR擴(kuò)增后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物1.5 μL做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有目的片段則表明實(shí)驗(yàn)成功。（3）PCR產(chǎn)物純化。在15 μL PCR產(chǎn)物中加入5 U SAP和2 U ExoⅠ酶，震蕩混勻，37℃保溫1 h，然后75℃保溫15 min以滅活SAP和ExoⅠ酶。純化好的模板可以在4℃保存24 h或-20℃長期保存。（4）延伸反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系（10 μL）包括5 μL SNaPshot Multiplex Kit （ABI），2 μL純化后多重PCR產(chǎn)物，1 μL延伸引物混合物，2 μL超純水。延伸反應(yīng)程序：96℃變性1 min；然后96℃變性10 s，55℃退火5 s，60℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；最后60℃延伸30 s。結(jié)束后4℃保存。延伸產(chǎn)物純化：在10 μL延伸產(chǎn)物中加入1U SAP，震蕩混勻，37℃保溫1 h，75℃保溫15 min以滅活酶，4℃可保存24 h或-20℃長期保存。（5）延伸產(chǎn)物測(cè)序。取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL Liz120 SIZE STANDARD，9 μL Hi-Di Formamide混勻，總體積10 μL，95℃變性5 min后上 ABI3730XL測(cè)序儀。運(yùn)用 GeneMapper4.1（Appliedbiosystems）軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，使用χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。運(yùn)用Haploview軟件分析S1、S2位點(diǎn)之間的連鎖不平衡關(guān)系；使用Phase軟件推斷群體樣本的單體型。組間基因型及等位基因頻率、單體型分布差異比較采用χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算OR值和95%CI。P＜0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果因ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)位置臨近，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為一段長365 bpDNA片段，見圖1。

2.2ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果S1位點(diǎn)對(duì)照組217個(gè)樣本基因分型成功，1個(gè)樣本基因分型失敗；病例組216個(gè)樣本基因分型成功，1個(gè)樣本基因分型失敗。S2位點(diǎn)對(duì)照組217個(gè)樣本基因分型成功，1個(gè)樣本基因分型失敗；病例組215個(gè)樣本基因分型成功，2個(gè)樣本基因分型失敗。測(cè)序結(jié)果經(jīng)GeneMapper4.1軟件處理后S1、S2位點(diǎn)的SNaP-shot圖像，見圖2、3。

Fig.1 The electrophoresis map of PCR product of part samples of S1，S2 locus in ADAM33 gene圖1 ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)部分樣品PCR產(chǎn)物電泳圖

Fig.2　S1 locus waveform and genotype of ADAM33 gene圖2ADAM33基因S1位點(diǎn)的波形和基因型

Fig.3　S2 locus waveform and genotype of ADAM33 gene圖3ADAM33基因S2位點(diǎn)的波形和基因型

2.3Hardy-Weinberg遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)S1位點(diǎn)病例組、對(duì)照組χ2分別為0.005、2.116，S2位點(diǎn)病例組、對(duì)照組χ2分別為0.118、0.013（均P＞0.05），2組研究樣本的群體代表性良好。

2.42組基因型及等位基因頻率分布比較病例組與對(duì)照組中S1、S2位點(diǎn)的基因型以及等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、3。

2.5病例組ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)基因型與肺功能相關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系S1、S2位點(diǎn)不同基因型間FEV1預(yù)計(jì)值（%）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S1、S2位點(diǎn)不同基因型間FEV1/FVC比較差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

2.6ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)之間連鎖不平衡及單體型分析S1、S2位點(diǎn)存在連鎖不平衡（D′值= 1）。單體型在病例組和對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

Tab.2　Comparison of S1 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表2　病例組與對(duì)照組S1位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較　例（%）

Tab.3　Comparison of S2 locus genotype and allele frequency distribution between two groups表3　病例組與對(duì)照組S2位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布比較　例（%）

Tab.4 The relationship between S1,S2 locus genotype of ADAM 33 gene and clinical indicators of lung function in patient group表4病例組ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)基因型與肺功能指標(biāo)的關(guān)系　（%,±s）

均P＞0.05

S1位點(diǎn)基因型C/C C/T+T/T t n 188 28 FEV1預(yù)計(jì)值57.40±12.55 58.75±12.11 0.532 FEV1/FVC 56.02±9.43 56.79±9.73 0.401 S2位點(diǎn)基因型C/C C/G G/G F n 123 78 14 FEV1預(yù)計(jì)值58.25±12.48 56.50±12.41 58.43±13.31 0.499 FEV1/FVC 56.83±8.74 55.24±9.51 54.71±14.59 0.831

3　討論

ADAM 33是ADAM基因超家族的一員，編碼ADAM 33的基因定位于20號(hào)染色體短臂（20p13），含22個(gè)外顯子和21個(gè)內(nèi)含子，長度超過14 kb，編碼一種基質(zhì)金屬蛋白酶，包含813個(gè)氨基酸，其結(jié)構(gòu)類似于ADAM家族的其他成員，由8個(gè)結(jié)構(gòu)域組成［4］。2002年，Van Eerdewegh發(fā)現(xiàn)ADAM 33與哮喘相關(guān)，可作為其候選基因。近期研究發(fā)現(xiàn)，ADAM 33可以影響多種疾病表型；在慢性氣道疾病中，對(duì)于ADAM 33基因的認(rèn)識(shí)不再僅局限于支氣管哮喘。人們又把ADAM 33基因作為COPD的易感基因在不同人群中進(jìn)行研究［5］。目前研究表明，ADAM 33基因多態(tài)性是COPD發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素［3］，但ADAM 33基因多態(tài)性是如何參與COPD的發(fā)病機(jī)制與病情進(jìn)展，以及如何影響其發(fā)病尚未完全明了。

Tab.5　Comparison of S1,S2 locus haplotype frequency between two groups表5　病例組和對(duì)照組S1、S2位點(diǎn)單體型頻率比較例（%）

最近關(guān)于ADAM33基因多態(tài)性與COPD的關(guān)聯(lián)性研究較多，其中ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)多態(tài)性在不同人群中的研究結(jié)果也不盡相同。2007年Gosman等［6］對(duì)參與GLUCOLD計(jì)劃的COPD患者進(jìn)行研究，分析了ADAM 33基因的8個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1、T2、S2、ST+5等4個(gè)位點(diǎn)與COPD的易感性相關(guān)，而Q-1、S1、F+1、V4與COPD無相關(guān)性。Tan等［7］對(duì)中國蒙古族人群ADAM 33基因的8個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)行基因型分型，發(fā)現(xiàn)S1、S2、Q-1和F+1位點(diǎn)與COPD有一定相關(guān)性。Sadeghnejad等［8］對(duì)高加索人群中的研究發(fā)現(xiàn)Q-1、S1、S2、V1、V4位點(diǎn)與COPD易感性相關(guān)。Zhou等［9］對(duì)亞洲人群ADAM 33基因的9個(gè)多態(tài)性基因位點(diǎn)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示T1、T2、S1、Q-1、F+1、ST+5位點(diǎn)與COPD的發(fā)生有關(guān)聯(lián)；而V4、T+1、S2位點(diǎn)與COPD無關(guān)聯(lián)。Li等［10］對(duì)中國人群ADAM 33基因中的T1、S2位點(diǎn)進(jìn)行Meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)S2位點(diǎn)與COPD無關(guān)聯(lián)。以上研究結(jié)果的不同表明目前對(duì)于S1、S2位點(diǎn)與COPD的發(fā)生有無相關(guān)性仍無定論。

本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)多態(tài)性及單體型與COPD具有相關(guān)性。這可能與種族、地域的差異有關(guān)，不同人群與COPD相關(guān)的ADAM 33基因SNP位點(diǎn)可能不盡相同。且此次試驗(yàn)只對(duì)ADAM33基因上的2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了研究，對(duì)于其他位點(diǎn)與新疆維吾爾人群COPD患者的關(guān)系尚不清楚。也有可能因?yàn)镃OPD發(fā)病的調(diào)節(jié)因素眾多，單個(gè)基因的研究不能反映COPD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的不同都可使基因頻率分布不同，所以有必要進(jìn)一步檢測(cè)ADAM33基因中其他區(qū)域的多態(tài)性位點(diǎn)與COPD的關(guān)系，建立一個(gè)完整的與疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的基因體系。另外本次試驗(yàn)檢測(cè)的樣本量并不能完全代表整個(gè)人群的基因突變情況，應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量降低造成ADAM33基因多態(tài)性位點(diǎn)假陰性結(jié)果的可能。

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（2014-09-24收稿2014-11-01修回）

（本文編輯李國琪）

Association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM33 gene and chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang Uygur population

HAO Ee，GUAN Jian△，XU Xilin，GAO Yan，ZHANG Zhonghong，WANG Shasha，WANG Shan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China
△Corresponding AuthorE-mail:guanjian6@163.com

ObjectiveTo investigate the association between polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and lung function in Xinjiang Uygur population.MethodsBlood samples from 217 COPD patients and 218 healthy controls were collected.Samples of DNA was extracted，and S1，S2 single nucleotide polymorphism（ADAM 33）was detected by ABI SNaPshot SNP genotyping.ResultsThere were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CT，TT genotypes and C，T alleles between patient group and control group（P＞0.05）.There were no significant differences in the frequencies of S1 locus CC，CG，GG genotypes and C，G alleles between patient group and control group（P＞0.05）.In patient group，there were no significant differences in S1，S2 locus genotype and clinical indicators of lung function display，and in the FEV1%predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.Haplotype analysis showed that there were no significant differences in three kinds of haplotypes between patient group and control group（P＞0.05）.ConclusionThere is no significant difference in the polymorphism of S1，S2 locus allele in ADAM 33 gene and the susceptibility to COPD in Xinjiang Uygur population.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；UYGUR nationality；ADAM 33

R563

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.002

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360009）

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（郵編832008）

郝娥娥（1988-），女，碩士研究生，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究

△E-mail:guanjian6@163.com