短乳桿菌JH-1體外降膽固醇機理的初步探討

姜 華，陸兆新（1．南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095;2．徐州醫學院公共衛生學院，江蘇徐州 221004）

膽固醇又稱膽甾醇，是人體必需的營養成分，具有很多重要生理功能，如參與血漿脂蛋白合成，轉化為膽汁酸鹽，合成類固醇激素等［1］。然而，體內過多的膽固醇積累嚴重威脅著人類的健康。研究表明，動脈粥樣硬化、冠心病、腦中風等心血管疾病發生率的不斷提高與膽固醇的不正常代謝密切相關［2］。

自20世紀70年代以來，人們發現定植于腸道的微生物具有顯著降低血清膽固醇水平的能力。這些研究成果已引起國內外營養學、醫學、微生物學等各界人士的普遍關注，其中以乳酸菌降解血清膽固醇水平的研究最多［2－5］。迄今，已有大量研究證實不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇的效果。但是，目前關于乳酸菌降解膽固醇作用機理尚未定論。普遍認為，這是以下3種機理協同作用的結果［6－8］。①共沉淀作用:乳酸菌產生的膽鹽水解酶（Bile salt hydrolase，BSH）可催化腸道中的結合型膽鹽水解成去結合膽酸，其溶解度降低且形成沉淀后排出體外，促使更多的膽固醇代謝合成新的膽汁鹽，降低血清膽固醇濃度;②同化作用:乳酸菌將膽醇吸收至細胞內，從而降低體內環境中膽固醇濃度;③摻入細胞膜:膽固醇可以在乳酸菌生長過程中結合到菌體細胞膜或細胞壁上。筆者以實驗室前期篩選的具有降解膽固醇性能的短乳桿菌JH-1為研究對象，初步探討短乳桿菌JH-1降解膽固醇的作用機理，為開發新型降膽固醇乳酸菌制劑提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 主要試驗材料

1．1．1 菌株。短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1，由南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保藏。

1．1．2 試劑。膽固醇標準物質，分析純，純度99%，美國sigma公司;乙腈、異丙醇、甲醇，色譜純，美國Tedia公司;其他試劑均為國產分析純。

1．1．3 培養基。MRS培養基組成為:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸三銨2．63 g，磷酸氫二銨2 g，七水硫酸鎂0．58 g，一水硫酸錳 0．20 g，Tween-80 1 ml，蒸餾水1 000 ml。固體培養基在液體培養基的基礎上添加1．5%的瓊脂。

高膽固醇MRS-CHOL培養基［9］配制方法為:準確稱量膽固醇0．1 g放入小燒杯中，加入0．2 g牛膽鹽、0．1 g蔗糖酯、1 ml吐溫80攪拌均勻，再移取5 ml冰乙酸加熱溶解，把溶解液用超聲波處理15 min后，快速加入到配制好的液體培養基中，邊加入邊攪拌，使其形成均勻、穩定的膠體溶液。

1．1．4 主要儀器。Agilent 1100高效液相色譜，美國Agilent公司;UV-2450紫外分光光度計，日本島津;centrifuge 5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司;電子精密天平，德國Sartorius;SW-CJ-IBU超凈工作臺，蘇州凈化。

1．2 試驗方法

1．2．1 菌種活化。將－20℃保存的短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1轉接至MRS斜面培養基，37℃培養24 h，然后挑取一環菌接種于液體MRS培養基，37℃培養24 h，如此轉接培養2次，即為活化菌種。

1．2．2 膽固醇共沉淀作用分析。取經活化的短乳桿菌Lactobacillus brevisJH-1培養液2 ml，分別接種于100 ml含有牛膽鹽和不含牛膽鹽的 pH 為 4．0、5．0、6．0、7．0 的 MRS-CHOL培養基中，37℃培養24 h。分別取上述培養物10 ml，于4℃、10 000 r/min離心10 min，取1 ml上清液備用;棄除上清液，用10 ml無水乙醇重懸菌體，于4℃、10 000 r/min離心10 min，取1 ml洗滌液備用;棄除洗滌液，加入10 ml無水乙醇重懸菌體，冰水浴超聲波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），4℃、10 000 r/min離心10 min，上清即為菌體破碎液。采用高效液相色譜法，測定上述培養物的發酵上清液、菌體洗滌液和菌體破碎液中膽固醇含量。

1．2．3 膽固醇同化作用分析。取經活化的短乳桿菌Lactobacillus brevis JH-1培養液2 ml，分別接種于100 ml MRSCHOL培養基中，37℃培養4 h后，每隔4 h取樣50 ml，于4℃、10 000 r/min離心10 min。取10 ml上清，加入5 ml乙酸乙酯，混勻后靜置萃取過夜，取上層萃取液1 ml，揮干后加入1 ml無水乙醇，以0．22 μm滅菌濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液進行HPLC分析。

菌體沉淀用10 ml無水乙醇重懸洗滌，于4℃、10 000 r/min離心10 min。棄除洗滌液，再加入10 ml無水乙醇重懸菌體，冰水浴超聲波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），并于4℃、10 000 r/min離心10 min，上清即為菌體破碎液。取上清液4 ml，揮干后加入1 ml無水乙醇，以0．22 μm滅濾膜過濾，取濾液作為供試品溶液進行HPLC分析。

1．2．4 菌體細胞對超聲波的抗性。取經活化的短乳桿菌Lactobacillus brevis JH-1培養液2 ml，分別接種于100 ml MRSCHOL培養基和和MRS液體培養基中，37℃培養24 h后，取10 ml菌液4 000 r/min離心10 min，并且收集菌體沉淀，用生理鹽水重新懸浮沉淀，調整菌體濃度為108cfu/ml。取10 ml的重懸液，冰水浴超聲波破碎（500 W，工作5 s，歇10 s，共20 min）。破碎菌液用生理鹽水稀釋，涂布MRS平板計數，以未經超聲破碎的菌懸液為對照，研究超聲破碎處理對細胞存活率的影響。

1．2．5 HPLC 測定膽固醇含量。

1．2．5．1 膽固醇標準溶液的配制。準確稱取膽固醇50．0 mg于25 ml無水乙醇中，并且用無水乙醇定容至50 ml容量瓶中，制成1 g/L膽固醇標準溶液。標準膽固醇工作液配制方法為:取標準膽固醇儲備液，分別以無水乙醇稀釋，使其濃度分別為 0．125、0．250、0．500、0．750 和 1．000 g/L。

1．2．5．2 色譜條件。參照譚來勛等［10］建立的膽固醇高效液相色譜法進行，略有改動。具體色譜條件如下:色譜柱為美國Agilent公司反向色譜柱 ZORBAX．Eclipse XDB-C18柱（4．6 ×250 mm，5 μm）;流動相 A（乙腈 +1‰ 三氟乙酸）—流動相B（異丙醇）按60∶40的比例進行等梯度洗脫，流速為0．5 ml/min;柱溫40℃;檢測波長為205 nm。膽固醇標準物質或樣品溶液20 μl進樣。洗脫時間15 min。

1．2．5．3 標準曲線的繪制及樣品中膽固醇濃度的計算。分別取20 μl標準膽固醇工作液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定標準溶液的峰面積，以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。分別取20 μl樣液注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定樣液的峰面積，由標準曲線回歸方程式計算樣液中膽固醇含量。

2 結果與分析

2．1 色譜圖結果 采用高效液相色譜法，測定膽固醇標準溶液和樣液中膽固醇的濃度。膽固醇標準物質的保留時間為11．503 min（圖1a）。按照“1．2．2”中的方法對樣品進行處理后，發酵液上清液中膽固醇的保留時間約為11．5 min（圖1b）。可見，膽固醇的前后無干擾峰，已與樣品中其他物質得到很好的分離。

2．2 標準曲線繪制及樣品中膽固醇濃度的計算 以峰面積（y）對膽固醇標準溶液濃度（x）作線性回歸，制作膽固醇標準曲線（圖2）。當膽固醇標準溶液濃度在0～1．0 g/L范圍內，膽固醇獲得較好的分離，其線性方程為y=13 997x+315．62（R2=0．999 5）。將樣品溶液的峰面積代入回歸方程，即可計算出樣品溶液中膽固醇的含量。

2．3 膽固醇共沉淀作用分析 Klaver等［11］提出，去結合型膽汁鹽在較低的pH條件下（pH＜6），可以同膽固醇共同沉淀析出，因此發生共沉淀需要同時具備酸性環境和膽鹽兩個條件。由圖3可知，短乳桿菌JH-1在含有膽鹽與不含膽鹽的MRS-CHOL中培養后，2種菌體洗滌液中膽固醇含量基本沒有變化。當含有膽鹽且 pH 為4．0、5．0、7．0時，菌體洗滌液中膽固醇含量為0;當pH為6．0時，洗滌液中膽固醇含量0．54%。根據共沉淀作用發生所需的兩個條件，發現在酸性條件下短乳桿菌JH-1并沒有發生共沉淀現象。研究結果表明，共沉淀作用不是短乳桿菌JH-1降膽固醇的途徑。

2．4 膽固醇同化作用分析 通過對短乳桿菌JH-1不同培養時間的發酵上清液和菌體破碎液中膽固醇進行HPLC測定，同時得出發酵上清液與菌體破碎液中膽固醇峰面積的變化趨勢。由圖4可知，在短乳桿菌JH-1發酵過程中，上清液膽固醇含量逐漸下降，經超聲波處理后細胞破碎液中的膽固醇含量持續上升，培養24 h后破碎液中膽固醇濃度占30．03%。研究結果表明，同化作用是短乳桿菌JH-1降膽固醇的主要途徑。

2．5 菌體細胞對超聲波的抗性 將菌懸液用超聲波在500 W下處理20 min后，研究短乳桿菌JH-1在不同培養條件下的菌體細胞對超聲波的抗性。Noh等［11－14］分別對加膽固醇和不加膽固醇的培養基下生長的乳酸菌進行超聲處理，發現前者更耐超聲處理，原因可能是吸收到細胞壁（膜）中的膽固醇改變了細胞的組成，增加了膜的韌性，從而使菌體抗性增強。由圖5可知，超聲波處理對短乳桿菌JH-1影響較大，在高膽固醇培養基MRS-CHOL的菌體的存活率比在MRS液體培養基中培養的菌體細胞的存活率高30%。這說明膽固醇被短乳桿菌JH-1吸收到細胞壁（膜）中，增加了膜的韌性，從而增強了菌體抗性。

3 結論與討論

該研究對前期實驗室篩選得到的短乳桿菌JH-1體外降膽固醇的機理進行了初步探討。通過分析同化作用、共沉淀作用和摻入細胞膜3種乳酸菌降膽固醇作用機理，初步判定短乳桿菌JH-1體外降膽固醇作用是同化作用和摻入細胞膜共同作用的結果。與常規的膽固醇測定方法比色法相比，該研究采用HPLC法測定發酵上清液與細胞破碎液中的膽固醇。試驗結果更準確、可靠。此外，短乳桿菌JH-1是從金華火腿中分離得到的一種乳酸菌，是一種公認安全的菌種，因而具有較高的安全性。這為后續研究降膽固醇乳酸菌制劑奠定了理論基礎。

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