壯骨鎮痛膠囊對裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表達的影響

曹建雄，馮志威，何迎春，畢四麗，王文美，何丹，柳景紅（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙40007；.湖南中醫藥大學，湖南長沙4008；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，湖南長沙40007）

壯骨鎮痛膠囊對裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表達的影響

曹建雄1，馮志威2，何迎春2，畢四麗2，王文美2，何丹2，柳景紅3*
（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科，湖南長沙410007）

目的研究壯骨鎮痛膠囊對裸鼠乳腺癌骨轉移整合素αvβ3表達的影響。方法將32只裸鼠接種乳腺癌細胞后，再隨機分為壯骨鎮痛膠囊預防組（下稱預防組）、壯骨鎮痛膠囊治療組（下稱治療組）、氯磷酸二鈉膠囊對照組（下稱對照組）和模型組，每組各8只，分別予以上述相應藥物干預，測定各組的抑瘤率，將移植瘤分離后進行切片，HE染色，并用光鏡觀察其病理形態，采用免疫組化方法檢測移植瘤組織細胞黏附遷移相關的整合素αvβ3表達。結果預防組抑瘤率最高，與其他各組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組和對照組抑瘤率相當，兩者比較（P＞0.05）。與模型組比較，各組整合素αvβ3表達差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組與對照組比較（P＞0.05），而預防組αvβ3表達顯著低于治療組及對照組（P＜0.05）。結論壯骨鎮痛膠囊能抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生長，其作用機制可能與移植瘤組織整合素αvβ3表達有關，預防組的效應比治療組效應強。

裸鼠乳腺癌；骨轉移；壯骨鎮痛膠囊；整合素αvβ3；裸鼠

〔Abstract〕Objective To study the effect of Zhuanggu Zhentong capsule on the expression of integrin-αVβ3 in nude mice with breast cancer metastatic tumor bone metastasis.Methods 32 nude mice inoculated with breast cancer cells were randomly divided into the prevention group of Zhentong Zhuanggu capsule（prevention group），the treatment of Zhentong Zhuanggucapsule（treatmentgroup），thecontrolgroupofClodronatecapsule（controlgroup）andthemodelgroup. Each group had eight nude mice and was with the drug intervention.The inhibition rate of tumor was determined，the metastatic tumor was spilt，and the pathological feature was observed by light microscope after HE staining.The expressionsofintegrin-αVβ3inadhesionmigrationrelativelyofmetastatictumortissuecellsweredetectedby immunohistochemical method.Result Compared with other groups，the inhibition rate of tumor in prevention group was the highest，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The inhibition rate of tumor of in treatment group and control group was almost at the same（P＞0.05）.Compared with the model group，the differences of integrin-αVβ3 expression in the other groups had statistically significant（P＜0.05）；the treatment group was compared with the control group（P＞0.05），while the αVβ3 expression in the prevention group was lower than that in prevention group and control group（P＜0.05）. ConclusionZhuangguZhentongcapsulecouldrestrainthegrowthofnudemousebreastcancermetastatictumor. The mechanism of action might be related to the expression of integrin-αVβ3 of metastatic tumor tissue，the effect ofprevention group was better than the treatment group.

〔Keywords〕naked mouse breast cancer；bone metastasis；Zhuanggu Zhentong capsule；integrin-αVβ3；nude mouse

乳腺癌最常見的遠處轉移部位之一是骨骼，約占晚期乳腺癌患者的70%［1］，骨轉移臨床表現中最主要的特點是出現頑固性疼痛，并出現進行性加重，同時伴隨系列并發癥，比如骨質疏松、病理性骨折等。整合素家族是一類異二聚體跨膜糖蛋白，這種糖蛋白是由一個α亞單位和一個β亞單位組成的，這兩種亞單位按照不同的組合構成20余種整合素。它主要介導細胞和細胞基質之間的相互黏附和信號傳導，在體內廣泛表達。其中，整合素αvβ3參與許多類型腫瘤的血管生成、侵襲、轉移，對于引起乳腺癌的骨轉移起到極為重要的作用。前期研究表明，壯骨鎮痛膠囊的功效包括控制或縮小骨轉移病灶，減少骨相關事件。本實驗旨在從分子水平研究經壯骨鎮痛膠囊干預后，裸鼠乳腺癌移植瘤模型中整合素αvβ3表達活性的變化，探討壯骨鎮痛膠囊防治乳腺癌骨轉移的作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物BALB/c裸小鼠，體質量（18±3）g，SPF級，雌性，購自湖南中醫藥大學動物實驗中心，動物合格許可證號：SCXK（湘）2009-0004，SPF級動物房飼養。高溫高壓消毒飼料及墊料，自由喂養，塑料瓶自由飲用消毒的自來水。飼料及實驗室均由湖南中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2細胞株人類乳腺癌細胞系MDA-MB-231，購于中南大學湘雅醫學院現代實驗中心細胞庫。

1.1.3藥物制備（1）壯骨鎮痛膠囊由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制備，藥物組成：淫羊藿、補骨脂、骨碎補、桑寄生、穿山甲、黃芪、黨參、三七、雞血藤、延胡索、威靈仙、制南星、制地龍、全蝎、蜈蚣、陳皮、甘草，生產批號20101018，規格：0.45 g× 24粒/瓶。取壯骨鎮痛膠囊0.45 g，先將膠囊去殼，內容物用10 mL無菌生理鹽水溶散搖勻，制成0.045 g/mL藥液，4℃保存。（2）氯磷酸二鈉膠囊藥液的制備拜耳醫藥保健有限公司生產，國藥準字J20120040，規格400 mg×60粒/盒。將抗骨轉移藥物氯磷酸二鈉膠囊0.8 g溶于10 mL生理鹽水中，制成0.08 g/mL備用，4℃保存。

1.1.4試劑RPMI-1640培養基由北京鼎國昌盛生物技術公司生產；胰蛋白酶粉由北京中杉生物技術公司生產；新生小牛血清由杭州四季青公司提供；二甲基亞砜（DMSO）由北京鼎國公司提供；青霉素、鏈霉素由大連美羅制藥廠生產；H2O2內源性酶滅活劑由武漢博士德公司提供；即用型SABC免疫組化試劑盒（產品貨號：SA1050）、兔抗鼠ITG泰斯特公司生產。

1.1.5主要儀器AE31型倒置顯微鏡及Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統均由Motic公司生產；GB204型電子天平由瑞士梅特勒公司生產；80-2型離心機由上海手術器械廠生產。

1.2方法

1.2.1造模與分組MDA-MB-231是一種人乳腺癌細胞株，將其培養于含15%新生小牛血清的RPMI-1640培養液的培養瓶中，并進行細胞傳代。等到乳腺癌細胞長滿培養瓶，先使用D-Hank’s液洗滌之后，再以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將其消化，從中取出少許RPMI-1640培養液，并將其吹打成細胞懸液，同時將乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞制成細胞懸液于裸小鼠前腋皮下接種，根據文獻方法［2-3］（裸鼠左心室注射MDA-MB-231BO細胞法造模），建立了人乳腺癌皮下移植瘤模型。再將32只裸鼠按隨機數字表法分成4組，分別是：模型組、壯骨鎮痛膠囊預防組（下稱預防組）、壯骨鎮痛膠囊治療組（下稱治療組）以及氯磷酸二鈉膠囊對照組（下稱對照組）。

1.2.2給藥方法各組動物都在SPF級動物房中自由飲水、攝食，保持自然光照預適應1周，并接種乳腺癌細胞懸濁液。預防組在接種乳腺癌細胞后次日開始應用壯骨鎮痛膠囊濃縮液灌胃，其他各組待裸鼠乳腺癌移植瘤體積達到約5 mm3時（見1.3.1）計算移植瘤體積，以0.2 mL蒸餾水給模型組的鼠灌胃；裸鼠灌藥量按照人的等效劑量進行換算，即：小鼠灌胃劑量（g/kg）=等效系數×成人劑量（g）/成人體質量（60 kg）。預防組、治療組以壯骨鎮痛膠囊濃縮液0.5 g/（kg·d）灌胃；對照組以氯磷酸二鈉膠囊濃縮液0.2 g/（kg·d）灌胃；3組灌胃頻率均為每日2次，持續30 d后，采用斷頸法處死各組動物，分離移植瘤，并分別切取標本制片。

1.3指標檢測

1.3.1移植瘤體積測定V=a×b2π/6（V為腫瘤體積，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）。各組在接種乳腺癌細胞后次日開始檢查，每隔一天測定一次移植瘤體積。

1.3.2抑瘤率計算實驗結束時，完整剝取移植瘤組織，電子天平準確測量瘤體組織質量，按照公式計算，抑瘤率=（模型組平均瘤體質量-治療組平均瘤體質量）/模型組平均瘤體質量×100%。

1.3.3移植瘤組織HE染色及病理形態學觀察將移植瘤標本分離后，從中切取小部分，并將其固定于中性甲醛。之后取出組織塊，通過常規水洗、脫水、透明、浸蠟4個過程后以石蠟包埋，將蠟塊放置于切片機中，5 μm連續切片并展開，撈片貼附于載玻片上，以室溫保存，HE染色，光鏡觀察。

1.3.4整合素αvβ3的檢測將移植瘤標本分離后，切取小部分標本以多聚甲醛固定，經過梯度乙醇逐級脫水，透明，石蠟包埋，切片，切片厚度大約為5 μm，酒精脫蠟，PBS沖洗3次；3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，滴加5%BSA封閉液1 -2滴，蓋滿組織片，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不洗；取配好的一抗工作液50～100 μL覆蓋組織，4℃過夜；取過夜片，PBS沖洗3次；滴加生物素標記二抗，室溫孵育15 min；再以PBS沖洗3次；滴加試劑SABC 1～2滴，室溫孵育20 min；以PBS沖洗4次；拭去組織周圍多余殘留液，加50～100 μL DAB顯色液蓋滿組織片，孵育20 min；至PBS工作液中沖洗3次；以蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。按試劑盒要求操作。采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統分析并測定陽性產物的光密度值作為αvβ3表達活性。

1.4統計學分析

2　結果

2.1各組裸鼠瘤體質量及抑瘤率變化比較

與模型組比較，預防組、治療組、對照組瘤體質量均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。預防組瘤體質量低于治療組和對照組（P＜0.05），抑瘤率高于另兩組（P＜0.05）。對照組與治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2各組移植瘤病理形態學比較

模型組的細胞排列密集甚至重疊。細胞之間界限不清，細胞質少，細胞核呈圓形或橢圓形的泡狀，大核仁位于中央部位；治療組細胞則呈固縮狀態，細胞核通常染色質增多，核呈多形性，細胞內可見角化，偶見角化珠形成；對照組細胞呈固縮狀態，有細胞間橋和/或角化物，具有典型的不規則巢狀，細胞多形性及復層排列；預防組細胞固縮，密度增加，輪廓變形，與周圍細胞分離染色質變致密，著邊。見圖1（封三彩圖）。

2.3各組移植瘤組織整合素αvβ3表達的比較

與模型組比較，各組αvβ3表達差異有統計學意義（P＜0.05）；治療組與對照組比較（P＞0.05），而預防組αvβ3表達顯著低于治療組及對照組（P＜0.05）。見表2及圖2（封三彩圖）。

表1　各組藥物對裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比較（±s，n=8）

表1　各組藥物對裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比較（±s，n=8）

注：與模型組比較△P＜0.05；與預防組比較▲P＜0.05。下表同。

組別模型組預防組治療組對照組瘤體質量（g）0.898±0.046 0.387±0.046△0.570±0.044△▲0.583±0.032△▲抑瘤率（%）—56.84 36.49▲35.45▲

表2　各組裸鼠移植瘤整合素αvβ3表達的比較（±s，%）

表2　各組裸鼠移植瘤整合素αvβ3表達的比較（±s，%）

組別模型組預防組治療組對照組n8888 αvβ3 28.65±5.21 10.25±3.37△15.15±2.03△▲15.90±4.56△▲

3　討論

乳腺癌骨轉移（骨瘤）的病因病機有兩方面：一方面為久病或久用行氣活血、祛痰化毒之品，使腎虛不能生髓養骨，不榮則痛；另一方面為乳巖之毒乘虛深陷經髓骨骼，氣血痰濁瘀毒閉阻經絡，致不通則痛。壯骨鎮痛膠囊以中醫學“腎主骨生髓”的理論為指導，骨碎補為君藥，補腎強筋壯骨，活血散瘀止痛，標本兼顧；仙靈脾、補骨脂、桑寄生助君藥補腎生髓，三七粉、莪術、延胡索、威靈仙、穿山甲散結通絡、消腫定痛，為臣藥；以生黃芪補虛托毒，使攻不傷正；再以制南星化痰散結，陳皮理氣健脾和中，酒白芍柔肝緩急止痛，皆為佐藥；頑痹邪氣久羈，又以制地龍、全蝎、蜈蚣攻毒散結、搜剔止痛；地龍之寒能制約諸藥之溫燥太過，并能引藥力達病所，甘草補脾益氣，調和諸藥亦具佐使之用。諸藥合用，使腎虛得補，筋骨得榮、痰氣瘀毒結聚得化、血活絡通、疼痛得止。

整合素αvβ3能夠通過特有的途徑轉導信號，調節細胞的各種生物學功能。整合素αvβ3具有參與細胞與細胞外基質一系列結合反應的作用。在原發乳腺癌細胞、侵襲性乳腺癌細胞以及骨轉移灶的腫瘤細胞中整合素αvβ3的表達均呈陽性［4］。整合素αvβ3在破骨細胞中也大量表達，同時在破骨細胞介導的溶骨性骨轉移過程中發揮著至關重要的作用。整合素αvβ3能與骨組織中的骨橋蛋白和骨唾液蛋白等細胞外基質蛋白發生結合反應，介導乳腺癌細胞與骨小梁發生黏附［5］，從而導致乳腺癌骨轉移發生。

通過本項研究得出，預防組裸鼠平均瘤體質量明顯低于另外3組裸鼠，抑瘤率也高于另外2組裸鼠。病理形態觀察上，治療組細胞呈固縮，細胞有角化的趨勢。預防組細胞固縮，密度增加，輪廓變形。結果表明，壯骨鎮痛膠囊具有明顯抑制腫瘤生長并減小瘤體的作用。

既往研究證實［6-9］，壯骨鎮痛膠囊能壯骨鎮痛、控制或縮小骨轉移病灶，減少骨相關事件，同時已從體外實驗證實壯骨鎮痛膠囊能顯著抑制乳腺癌細胞的遷移、黏附、增殖等。而乳腺癌骨轉移發生的關鍵因素是腫瘤細胞和骨基質的黏附，腫瘤細胞轉移的基本因素是骨唾液蛋白的浸潤能力。在骨細胞、骨轉移的腫瘤細胞上的整合素αvβ3上存在著骨唾液蛋白的結合位點，通過二者結合效應，在腫瘤細胞黏附、浸潤和轉移中發揮重要作用。

壯骨鎮痛膠囊對乳腺癌移植瘤骨轉移具有一定的防治作用，該膠囊對于裸鼠乳腺癌移植瘤組織中整合素αvβ3的表達起到顯著抑制作用，通過抑制裸鼠乳腺癌移植瘤組織中整合素αvβ3的表達，抑制裸鼠乳腺癌移植瘤細胞黏附、浸潤效應，從而達到防治乳腺癌骨轉移的作用。但其具體的作用機制，尚待進一步研究。

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［8］柳景紅，何迎春，曹建雄，等.壯骨鎮痛膠囊對乳腺癌細胞遷移運信號通路關鍵蛋白P-JNK和Rac-1表達的影響［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（4）：802-804.

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（本文編輯徐愛良）

Effect of Zhuanggu Zhentong Capsule on the Expression of Integrin-αVβ3 in Breast Cancer Transplantable Tumor Naked Mouse Models

CAO Jianxiong1，FENG Zhiwei2，HE Yingchun2，BI Sili2，WANG Wenmei2，HE Dan2，LIU Jinghong3*
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；3.Department of Orthopedics and Traumatology，the First Affiliated Hospital of HUCM，Hunan，Changsha 410007，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.005.014.04

2014-06-09

湖南省自然科學基金項目資助（13JJ3103）；湖南省科技廳項目資助（2007TP4021）；湖南省科技廳項目資助（2010TT2020）；湖南省教育廳基金項目資助（09C724）。

曹建雄，男，博士，主任醫生，研究方向：中西醫結合防治腫瘤病。

*柳景紅，男，主任醫師，教授，E-mail：2274674521@qq.com。