王氏連樸飲對脾胃濕熱證大鼠血清ALD、血漿ADH和β-EP影響的研究

錢益嘯，李云鵬，陳景良，鐘偉麗，賀婧，文小敏*（.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州5055；.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院，廣東廣州5035）

王氏連樸飲對脾胃濕熱證大鼠血清ALD、血漿ADH和β-EP影響的研究

錢益嘯1，李云鵬1，陳景良2，鐘偉麗2，賀婧2，文小敏1*
（1.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣東廣州510515；2.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院，廣東廣州510315）

目的觀察脾胃濕熱證模型大鼠中血清醛固酮（ALD）、血漿抗利尿激素（ADH）及β-內啡肽（β-EP）的變化，并探討王氏連樸飲的調控作用。方法將40只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、王氏連樸飲（高、中、低劑量）組。除正常對照組外，其余各組均采用復合因素法（外部濕熱環(huán)境+肥甘飲食+病原微生物）造成脾胃濕熱證大鼠模型，造模后按不同劑量組給予中藥灌胃，采用放射免疫法檢測血清ALD、血漿ADH和β-EP的水平。結果與模型組比較，王氏連樸飲（高、中、低劑量）組ALD、ADH以及β-EP水平明顯降低（P＜0.01）；中劑量組與高、低劑量組之間比較水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。結論復合因素造模可以使脾胃濕熱證大鼠ALD、ADH和β-EP發(fā)生異常改變，王氏連樸飲可降低ALD、ADH和β-EP的釋放水平，且以中劑量組效果最好，這可能是其清熱祛濕的作用機制之一。

王氏連樸飲；脾胃濕熱證；醛固酮；抗利尿激素；β-內啡肽

〔Abstract〕ObjectiveTo observe the changes of serum ALD，plasma ADH and plasma β-EP in with damp-heat syndrome of spleen-stomach and the regulative action of Wangshi Lianpu drink（WSLPY）.Methods Forty male Wister rats wererandomlydividedintonormalcontrolgroup（NCG），modelgroup（MG），highdoseofWSLPYgroup （HWG），moderate dose of WSLPY group（MWG）and low dose of WSLPY group（LWG）.The mouse models in all groups but the normal control group were built with the compound factor method.The levels of ALD，ADH，and β-EP were detected by radioimmunoassay.Results Compared with normal control group，the concentration of ADH，β-EP in plasma and serum ALD of the rats in the model group increased significantly（P＜0.01）.Compared with the MWG and LWG，the MWG can reduce the levels of ADH，β-EP and ALD（P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion The complex factors way that establishing the model rats withthespleenandstomachdamp-heatsyndromecanchangetheconcentrationofADH，β-EPandALD. Wangshi Lianpu drink could regulate the status of ALD，ADH and β-EP which was probably one of its mechanisms of clearing heat and expelling damp.

〔Keywords〕Wangshi Lianpu drink；damp-heat syndrome of spleen-stomach；ALD；ADH；β-EP

脾胃濕熱證是指由于濕熱內蘊中焦，脾胃功能失調為主要證候的一類濕熱病證［1］，其臨床癥狀復雜多變，病程日久纏綿。在其發(fā)生發(fā)展過程中，多種致病因素、濕熱之邪和其他因素對人體的刺激引起機體做出應激反應，而下丘腦-垂體-腎上腺皮質（HPA）軸作為應激的樞紐，會發(fā)生神經(jīng)-內分泌的改變。本文擬通過復合因素（外部濕熱環(huán)境+肥甘飲食+病原微生物）造模［2-3］，探討脾胃濕熱證模型大鼠血清醛固酮（ALD）、血漿抗利尿激素（ADH）及β-內啡肽（β-EP）的變化，及王氏連樸飲清熱祛濕的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供40只SPF級雄性Wistar大鼠，體質量180～220 g，合格證號為SCXK（粵）2006-0015。

1.1.2藥物藥物均購自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院中藥房，參照清·王孟英《霍亂論》原方組成：制厚樸6 g，川黃連、石菖蒲、制半夏各3 g，香豉、焦山梔各9 g，蘆根60 g。把各藥物在水中浸泡至少30 min，加約為藥量8倍的水量，煎煮3次，采用冷凝管收集蒸汽中所揮發(fā)性的藥物成分，并將3次藥汁混合，離心取澄清藥汁。依據(jù)《中藥藥理研究方法學》［4］中的人與大鼠之間劑量換算公式（大鼠按200 g/只計算），濃縮配制成濃度為0.48、0.97、1.94 g/mL的藥液，存放于4℃冰箱備用。

1.1.3菌種及試劑ALD、ADH和β-EP放免試劑盒均購自北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司。侵襲性大腸桿菌，濃度為109/mL，由南方醫(yī)科大學微生物實驗室提供。

1.1.4高糖高脂飼料采用自制飼料，于普通飼料中混入12%豬油和8%蜂蜜混合加工而成，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心制作提供。

1.1.5主要儀器AvantiTM230型超速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；SN-695型放射免疫γ計數(shù)測量系統(tǒng)（上海核福光電儀器有限公司）；仿真模擬氣候倉［模擬濕熱環(huán)境設置為溫度（33±2）℃、相對濕度75%±5℅，由南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生熱帶學院提供］。

1.2方法

1.2.1動物分組將40只SPF級雄性Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法抽取8只，分在正常對照組，其余32只造模后隨機分為模型組、王氏連樸飲（高、中、低劑量）4組，每組8只。造模前所有動物適應性飼養(yǎng)3 d后禁食12 h，自由飲水。

1.2.2造模與給藥（1）正常對照組：在20～28℃溫度，50%～60%相對濕度的環(huán)境下，給以普通混合飼料、清水飼喂，每日上午9時投食。（2）脾胃濕熱證大鼠模型：在20～28℃溫度，50%～60%相對濕度環(huán)境下，給以高糖高脂飼料喂養(yǎng)10 d。然后置于仿真模擬氣候倉（每天上午9時至11時）共8 d。第19天回歸自然環(huán)境，上午9時開始灌胃：模型組按2 mL/200 g給予大腸桿菌1次，24 h后再加強感染1次（1 mL/200 g）；王氏連樸飲高、中、低劑量組分別給予濃度為1.94、0.97、0.48 g/mL的王氏連樸飲煎劑灌服大鼠（2 mL/200 g體質量），1次/d。7 d后所有動物處死取相關組織并做檢查。

1.2.3標本采集及檢測大鼠于處死前，禁食、不禁水12 h，用10%水合氯醛按照0.72 mL/200 g腹腔注射麻醉后迅速打開腹腔：（1）檢測ALD：經(jīng)腹主動脈采血2 mL置入普通采血管，待凝固后，進行4℃3 000 r/min離心10 min，分離血清，凍存于-20℃冰箱待測。（2）檢測ADH、β-EP：經(jīng)腹主動脈采血2 mL置入加有乙二胺四乙酸和抑肽酶的采血管內，輕緩混勻，進行4℃3 000 r/min離心10 min，分離血漿，凍存于-20℃冰箱待測。以上標本均利用放射免疫法檢測，按照試劑盒說明嚴格操作。

1.3統(tǒng)計學分析

2　結果

與正常對照組比較，模型組血清ALD、血漿ADH、β-EP顯著升高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。經(jīng)灌服王氏連樸飲1周后，與模型組比較，王氏連樸飲（高、中、低劑量組）的ADH和β-EP均有下降，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。對ADH、β-EP的影響，中劑量與高、低劑量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），而高劑量與低劑量之間，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對ALD的影響，王氏連樸飲（高、中、低劑量）組之間，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1　各組大鼠血清ALD、血漿ADH以及β-EP含量比較（±s，n=8，pg/mL）

表1　各組大鼠血清ALD、血漿ADH以及β-EP含量比較（±s，n=8，pg/mL）

注：與模型組比較**P＜0.01；與正常對照組比較##P＜0.01；與王氏連樸飲中劑量組比較△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別正常對照組模型組王氏連樸飲高劑量組王氏連樸飲中劑量組王氏連樸飲低劑量組ALD 0.13±0.02** 0.26±0.03 0.16±0.02** 0.14±0.02** 0.15±0.02** ADH 132.26±24.54** 295.99±34.33 235.05±24.49**##△△191.06±20.55**##241.14±23.57**##△△β-EP 472.37±33.68** 698.26±62.95 597.20±54.20**##△△511.59±51.66** 568.02±51.61**##△

3　討論

脾胃濕熱證是臨床常見和多發(fā)病證，其發(fā)生原因多樣，中醫(yī)認為主要和外部濕熱環(huán)境、飲食不節(jié)、內傷脾胃等多種因素有關。查閱相關文獻［5-8］發(fā)現(xiàn)：清代醫(yī)家王孟英在《霍亂論》中提出的王氏連樸飲是治療這一癥候的首選方之一，方中梔子、黃連性均苦寒，共奏清熱瀉火燥濕之功，而厚樸、半夏、石菖蒲三者配伍并施，苦溫和辛溫相配，辛苦開泄，燥濕化濁，半夏兼和胃止嘔之效，豆豉透熱，蘆根生津，有清熱燥濕、理氣化濁之功。

目前對脾胃濕熱證的相關發(fā)病機制仍不十分清楚，但考慮內外濕熱、肥甘厚膩以及濕熱之品刺激之下，機體內部會出現(xiàn)全身性的非特異性反應，以及神經(jīng)內分泌的興奮表現(xiàn)，在行為和內環(huán)境的代謝等各方面也都會產(chǎn)生相應的變化［9］，這可能與神經(jīng)內分泌系統(tǒng)的相關改變有關。本課題組［10］前期已通過大量相關實驗發(fā)現(xiàn)SPF級Wistar大鼠在脾胃濕熱復合因素造模的過程中，濕熱環(huán)境、高脂高糖飲食和生物刺激會讓大鼠發(fā)生一定的應激反應，神經(jīng)內分泌系統(tǒng)出現(xiàn)興奮，HPA軸進入亢進狀態(tài)，其中血清皮質醇和促腎上腺皮質激素分泌水平明顯增高。在神經(jīng)內分泌系統(tǒng)中，β-EP是一種與體內應激反應關系密切的內源性阿片肽，有研究表明［11］炎性疼痛使β-EP的消耗增多，促使體內合成與釋放更多的β-EP來對抗疼痛，使痛與鎮(zhèn)痛維持在一個較高的水平，這是機體對傷害性刺激自身的適應性調整。有研究顯示［12］縮泉丸可以增加自然衰老大鼠血中ALD和ADH的含量，有明顯的抗利尿作用，可以從調節(jié)水、電解質的重吸收和分泌發(fā)揮作用。劉德芳等［13］在進行濕阻中焦證大鼠造模過程中發(fā)現(xiàn)，濕阻中焦證大鼠的ADH釋放和ALD分泌水平均有升高的趨勢，提示兩者可能共同參與了濕阻中焦證模型中水、電解質平衡的調節(jié)。此外研究還發(fā)現(xiàn)［14］，在一定的熱暴露后，可引起機體水鹽代謝紊亂，并通過HPA軸的神經(jīng)內分泌參與了熱應激的反應，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)這在一過程中具有重要作用。而ALD也會作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的下丘腦，下丘腦分泌激素促使垂體釋放ADH，來進行腎小管對水分的重吸收作用。ALD、ADH的相互作用對水鹽代謝及維持機體內環(huán)境的恒定起著重要作用。

本實驗結果顯示脾胃濕熱證模型組大鼠ALD、ADH及β-EP的表達升高，與正常對照組比較有統(tǒng)計學意義，表明脾胃濕熱證大鼠機體在對抗?jié)駸岽碳ぃw內鈉離子及水份的吸收增加，遠端腎小管與集合管水分重吸收加強，被保留在體內，存在水、鈉潴留現(xiàn)象；灌服王氏連樸飲湯煎劑高、中、低3種劑量后，各組均有不同程度的降低，以中劑量組效果最好，ALD、ADH和β-EP表達與模型組比較有統(tǒng)計學意義，提示王氏連樸飲能調節(jié)內分泌激素使機體水電解質的平衡，適應環(huán)境改變，促進機體內穩(wěn)定，其機制可能與上調神經(jīng)內分泌激素表達有關，這可能是其清熱祛濕作用機制之一。

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（本文編輯匡靜之）

Effect of Wangshi Lianpu Drink on Serum ALD，Plasma ADH and β-EP in Rats with Damp-Heat Syndrome of Spleen-Stomach

QIAN Yixiao1，LI Yunpeng1，CHEN Jingliang2，ZHONG Weili2，HE Jing2，WEN Xiaomin1*
（1.College of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China；2.Hospital of Integrated TCM and Western Medicine，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510315，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.006.017.03

2014-11-12

廣東省中醫(yī)藥局項目資助（2008195）；廣東省中醫(yī)藥局項目資助（20131242）。

錢益嘯，男，在讀碩士研究生，主要從事脾胃病的基礎與臨床治療研究。

*文小敏，男，教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，E-mail：wxm@fimmu.com。