利用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器法分析鮰魚腦中磷脂組成

盧 航，里 慧，趙景華，何沁峰，李晶晶，丁宇寧，顏 澤，胡建恩（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連　116023）

利用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器法分析鮰魚腦中磷脂組成

盧 航，里 慧，趙景華，何沁峰，李晶晶，丁宇寧，顏 澤，胡建恩*
（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116023）

對(duì)鮰魚腦中的磷脂進(jìn)行提取純化，利用高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器法對(duì)鮰魚腦的磷脂含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：鮰魚腦磷脂中磷脂酰膽堿含量最高，占磷脂含量的45.73%，磷脂酰乙醇胺次之，含量為17.39%，磷脂酰絲氨酸含量為5.01%，磷脂酰肌醇含量為1.20%，相對(duì)較低。磷脂標(biāo)準(zhǔn)品在各自的質(zhì)量濃度檢測(cè)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，并且鮰魚腦的磷脂中各組分分離效果良好，對(duì)于其他磷脂樣品的測(cè)定也具有重要的參考價(jià)值。

鮰魚腦；磷脂；高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)器；定量分析

魚在加工過程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物，包括魚頭、魚皮、魚骨等。魚頭營(yíng)養(yǎng)豐富，除含蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷、鐵、VB等營(yíng)養(yǎng)成分之外，還含有豐富的磷脂成分，且主要集中在魚腦中，鰹魚腦中磷脂含量為22.5 mg/100 g濕腦［1］，是可被利用的磷脂資源。目前，磷脂的各種生理調(diào)節(jié)功能受到人們廣泛關(guān)注，現(xiàn)有研究［2］顯示，磷脂具有抗衰老、調(diào)節(jié)血脂、減少膽固醇、強(qiáng)化腦部功能、提高記憶等功能。Fran［3］發(fā)現(xiàn)卵磷脂與記憶功能有關(guān)；Harrison等［4］發(fā)現(xiàn)磷脂有減少貧血癥狀、增加血色素含量的功能；Friedman等［5］研究發(fā)現(xiàn)磷脂能使實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化現(xiàn)象減退；Buang等［6］發(fā)現(xiàn)磷脂酰膽堿可以緩解大鼠由乳清酸誘導(dǎo)的脂肪肝。

隨著人們生活質(zhì)量的日益提高，消費(fèi)習(xí)慣也在發(fā)生著變化，人們不再只是滿足吃活鮮魚，而是更多地轉(zhuǎn)向營(yíng)養(yǎng)化和具有保健功能的魚加工產(chǎn)品。因此，魚類副產(chǎn)物中的生物活性物質(zhì)的提取和功能特性的改善研究，將為魚類產(chǎn)業(yè)帶來更多的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值［7］。目前，磷脂分析常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，更為強(qiáng)大的液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)也用于磷脂的定向定量分析中。液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)不僅能將磷脂組間分離定量，還有助于未分離的同類磷脂化合物的檢測(cè)［8-9］。目前，HPLC法是磷脂分離和定性分析的主要方法。正相色譜分離不同種類的磷脂主要基于頭部基團(tuán)極性大小；反相色譜分離磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基鏈的疏水性不同，但是相比而言一般分離度較差，峰重合嚴(yán)重［8］。磷脂分析的流動(dòng)相一般分為2 類：正己烷-異丙醇-水體系和氯仿-甲醇-水（氨水）體系［10］。各種來源的磷脂都是由多種不同分子構(gòu)型的磷脂分子組成的混合物，并具有差異性，等度洗脫難以完全分離，紫外與示差擇光檢測(cè)器不適于梯度洗脫，而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light scattering detector，ELSD）法具有不受梯度洗脫及溶劑、基線干擾，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)［11］。為此本實(shí)驗(yàn)將對(duì)HPLC-ELSD在鮰魚腦磷脂中的應(yīng)用展開研究。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

鮰魚腦采自江蘇海天灘涂有限公司，于－20 ℃條件下保存。

磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰肌醇（proporphosphatidylinositol，PI）、溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)Sigma公司；正己烷、異丙醇（均為色譜級(jí)）瑞典Oceanpak公司；氯仿、甲醇、冰乙酸等其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LaChrom Elite系列HPLC儀日本日立公司；Chromolith?Performan-ce-Si型正相硅膠色譜柱（100 mm×4.6 mm）德國(guó)默克公司；Alltech 2000 ELSD美國(guó)Grace公司。

1.3方法

1.3.1鮰魚腦中總脂肪的提取

鮰魚腦總脂肪采用Folch等［12］方法進(jìn)行提取。將鮰魚腦流水解凍，勻漿后冷凍干燥，取5 g樣品轉(zhuǎn)移至燒杯中，加入180 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，攪拌，靜置10 min后抽濾，收集濾液，濾渣重復(fù)2 次上述操作。將上述所得濾液合并至分液漏斗中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液，振蕩搖勻后靜置過夜分層，收集下層氯仿層，通過無水硫酸鈉脫水后濾至旋蒸瓶，45 ℃真空旋蒸至干，所得殘余物即為總脂肪。氮?dú)獯蹈尚羝恐梁阗|(zhì)量后稱質(zhì)量，旋蒸瓶增加的質(zhì)量即為總脂肪質(zhì)量。

1.3.2鮰魚腦中膽固醇含量的測(cè)定

參照GB/T 5009.128—2003《食品中膽固醇的測(cè)定》［13］方法，測(cè)定鮰魚腦中膽固醇含量。

1.3.3鮰魚腦總脂肪組分的分離測(cè)定

總脂肪組分的分離測(cè)定采用硅膠柱層析法［14］。稱取100 g柱層析硅膠，在105 ℃活化1～2 h，取出冷卻至室溫。采用濕法裝住，將活化好的硅膠加入300 mL氯仿攪拌均勻至沒有氣泡，然后邊攪拌邊緩緩倒入層析柱（35 cm×2.1 cm），待硅膠柱平衡后，將含有600 mg總脂肪的少量氯仿溶液上樣，依次用氯仿洗脫中性脂，丙酮洗脫糖脂，甲醇洗脫磷脂，各自單獨(dú)收集后旋蒸至干、稱質(zhì)量，得到各脂肪組分質(zhì)量。

1.3.4鮰魚腦磷脂純化

鮰魚腦總脂肪提取液經(jīng)真空濃縮后，根據(jù)磷脂不溶于丙酮的性質(zhì)，將冷丙酮（4 ℃）倒入總脂肪濃縮液中，不斷攪拌，待沉淀析出后4 000 r/min離心5 min，吸取上清液，冷丙酮清洗沉淀，重復(fù)多次，直至上清液無色為止，用氮?dú)獯蹈芍频悯t魚腦磷脂，于－20 ℃冷凍保存，備用。

1.3.5鮰魚腦磷脂脂肪酸組成分析

制取的鮰魚腦磷脂采用三氟化硼法甲酯化后，參照GB/T 17377—2008《動(dòng)植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析》［15］的方法，進(jìn)行鮰魚腦的磷脂脂肪酸組成分析。

1.3.6磷脂樣品的制備

取適量鮰魚腦磷脂樣品，按照一定的質(zhì)量濃度溶解于正己烷-異丙醇（3∶1，V/V）混合液中。HPLC進(jìn)樣前使用0.22 μm孔徑有機(jī)相濾膜過濾雜質(zhì)。進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.7鮰魚腦磷脂HPLC分析

ELSD采用分流模式，以空氣作為霧化氣，氣體流速1.7 L/min，漂移管溫度45 ℃。采用三元梯度洗脫，流動(dòng)相A為正己烷（含0.04%三乙胺）；流動(dòng)相B為異丙醇；流動(dòng)相C為13%乙酸溶液。洗脫流速1.5 mL/min，柱溫25 ℃［16］，梯度洗脫程序如表1所示。將PE、PI、PS、PC、SM、LPC標(biāo)準(zhǔn)品分別單獨(dú)進(jìn)樣，記錄出峰時(shí)間，以對(duì)樣品磷脂進(jìn)行定性。然后將各種配好的磷脂標(biāo)準(zhǔn)品按梯度進(jìn)行稀釋，以磷脂標(biāo)品含量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，對(duì)鮰魚腦的磷脂進(jìn)行檢測(cè)。按其各峰的出峰時(shí)間確定磷脂的種類，根據(jù)各種磷脂的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各磷脂組分的相對(duì)含量。

表1　　梯度洗脫流動(dòng)相組成Table 1　　Ternary gradient mobile phase composition

2　結(jié)果與分析

2.1鮰魚腦中脂質(zhì)組成從表2可以看出，鮰魚腦中總脂肪含量達(dá)37.65%；膽固醇占總脂肪比例為1.84%，低于雞蛋中膽固醇含量（4%）［17］。磷脂占總脂肪的比例為43.17%，遠(yuǎn)大于大豆的6.67%，低于蛋黃的45.2%［18］。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)測(cè)定的鮰魚腦中的含水量為85.76%，因此，以濕質(zhì)量計(jì)算鮰魚腦的磷脂含量為23.14 mg/100 g，接近于魚腦濕質(zhì)量的

表 22 　鮰魚腦中總脂肪含量及膽固醇、中性脂、糖脂和磷脂比例TTaabbllee 22 　TToottaall lliippiiddss ccoonntteennttss aanndd pprrooppoorrttiioonnss ooff cchhoolleesstteerrooll， nneeuuttrraalllliippiiddss， ggllyyccoolliippiiddss aanndd pphhoosspphhoolliippiiddss iinn cchhaannnneell ccaattffi i sshh bbrraaiinn %

2.3%，干質(zhì)量的16%。據(jù)文獻(xiàn)［19］報(bào)道扇貝卵巢中磷脂占濕質(zhì)量的1.0%，干質(zhì)量的5.5%；鱈魚卵中磷脂占濕質(zhì)量的2.2%，干質(zhì)量的7.6%，與這2 種海產(chǎn)類動(dòng)物原料比較，鮰魚腦的磷脂含量相對(duì)較高，因此以鮰魚腦為原料開發(fā)磷脂，具有良好的發(fā)展空間。

2.2鮰魚腦的磷脂脂肪酸組成

表 33 　鮰魚腦的磷脂中主要的脂肪酸組成Taabbllee 33 　FFaattttyy aacciidd ccoommppoossiittiioonn ooff pphhoosspphhoolliippiiddss ffrroomm tthhee ffi i sshh bbrraaiinn %

由表3可以看出，鮰魚腦磷脂的脂肪酸主要有

C15∶1、C18∶0、C18∶1 n9c、C20∶5 n3、C22∶6 n3，且二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）含量分別為12.3%和1.7%。鮰魚腦的磷脂中含有大量的不飽和脂肪酸，約占總脂肪酸的62.77%。

2.3混合磷脂標(biāo)準(zhǔn)品與鮰魚腦的磷脂HPLC分析

由圖1可以看出，在本實(shí)驗(yàn)的洗脫條件下，混合磷脂標(biāo)準(zhǔn)品和魚腦磷脂中的所有磷脂組分均能達(dá)到基線分離，峰形良好，并且溶劑峰并不影響各磷脂的分離與定量分析。各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表4。從表4可以看出，各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，說明ELSD的輸出信號(hào)與進(jìn)樣量的對(duì)應(yīng)關(guān)系在本實(shí)驗(yàn)所選定的檢測(cè)范圍之內(nèi)是線性的。

圖1　 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品（AA）　、鮰魚腦的磷脂（B）HPLC-EELLSSDD圖Fig.1　Chromatogram of phospholipids from channel catfi sh brain by HPLC-ELSD

表 4　磷脂標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及R2值Table 4　Equations andd R2values of calibration curves for phospholipid standaarrddss

2.4鮰魚腦的磷脂組成

表 55 　鮰魚腦的磷脂組成Taabbllee 55 　PPhhoosspphhoolliippiidd ccoommppoossiittiioonnss ooff cchhaannnneell ffi i sshh bbrraaiinn%

從表5可以看出，在鮰魚腦磷脂中PC是磷脂的重要組成部分，占鮰魚腦的磷脂45.73%。PE同樣也占磷脂組成的很大比例，達(dá)到魚腦磷脂的17.39%。在鮰魚腦的磷脂中，存在一定量的PI以及PS，含量分別為1.20%和5.01%。鮰魚腦的磷脂中并未檢測(cè)出SM以及LPC。

3　討 論

磷脂作為一種功能性脂質(zhì)在生命代謝活動(dòng)中有極其重要的作用［20］，此外，磷脂是天然的表面乳化劑，具有乳化、分散、潤(rùn)濕、速溶、脫膜、分離等作用［21］。其可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，降低血脂中甘油三酯和膽固醇水平。多烯磷脂酰膽堿作為磷脂的一種已在臨床上作為肝病輔助治療藥得到廣泛利用［22］，因此磷脂生物活性包括減肥、抗癌、降血糖等方面［23-25］，也必將越來越受到人們的重視。而對(duì)其所含磷脂組成的分析方法，將為其利用提供科學(xué)的依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)利用正己烷-異丙醇-水體系為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在選定的色譜條件下，可以快速對(duì)各磷脂類組分完成檢測(cè)分析，并且各組分峰的分離效果良好并且線性關(guān)系良好，表明該方法是一種快速、準(zhǔn)確測(cè)定磷脂含量的分析方法，也可應(yīng)用于其他來源磷脂組成的檢測(cè)。

［1］張麗. 鰹魚腦的磷脂提取及活性研究［D］. 大連： 大連海洋大學(xué)，2012.

［2］吳世芳. 何首烏中磷脂類化合物的提取、分離及分析方法研究［D］.南昌： 南昌大學(xué)， 2007.

［3］FRAN L B. Lecithin fraction linked to memory functioning［J］. Prepared Foods， 1998， 167（8）: 129.

［4］HARRISONE E， AADJEI A， AMEHO C， et al. The effect of soybean protein on bone loss in a rat model of postmenopausal osteoporosis［J］. Journal of Nutritional Science and Vitaminology， 1998， 44（2）: 257-268.

［5］FRIEDMAN M， BYER S O， ROSEMAN R H. Resolution of aortic atherosclerotic infiltration in the rabbit by phosphatide in fusion［J］. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1957， 95（3）: 586-588.

［6］BUANG Y， WANG Yuming， CHA J Y， et al. Dietary phosphatidylcholine alleviates fatty liver induced by orotic acid［J］. Nutrition， 2005， 21: 867-873.

［7］陳海光， 黃東雨， FELICIA K. 海洋魚類廢棄物功能成分提取的研究［J］.食品與機(jī)械， 2010， 26（3）： 173-176.

［8］姚凱， 薛蕓， 李靜， 等. 磷脂分析方法的研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2014， 15（14）： 2972-2975.

［9］朱超. 基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的磷脂組學(xué)平臺(tái)的建立、改進(jìn)及應(yīng)用［D］. 上海： 華東理工大學(xué)， 2011.

［10］ 曹棟. HPLC-ESLD法分離測(cè)定大豆磷脂酰膽堿［J］. 中國(guó)油脂， 2005，30（12）： 43-45.

［11］ MARTIN G， DIETER J. Improved separation and quantification of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase： application to exceptional marine lipids［J］. Journal of Chromatography B， 2009， 877： 1815-1819.

［12］ FOLCH J， LEES M， STANLE Y. A simple method for the isolation and purifi cation of total lipids from animal tissues［J］. Journal of Biological Chemistry， 1957， 226： 497-509.

［13］ 衛(wèi)生部， 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 5009.128—2003 食品中膽固醇的測(cè)定［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2003.

［14］ 張智翠. 太平洋牡蠣品質(zhì)的季節(jié)性變化及貯藏過程中的生化變化［D］.青島： 中國(guó)海洋大學(xué)， 2006.

［15］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局， 中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 17377—2008 動(dòng)植物油脂脂肪酸甲脂的氣相色譜分析［S］. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008.

［16］ GRZEGORZ K， PIOTR M， CZES?AW W. A new liquid chromatography method with charge aerosol detector （CAD） for the determination of phospholipid classes. Application to milk phospholipids［J］. Talanta， 2013， 105： 28-33.

［17］ 李志軍， 王玲玲， 呂寧華. 水產(chǎn)保健食品的研究現(xiàn)狀與展望［J］. 食品工業(yè)， 2003， 24（5）： 42-43.

［18］ 林洪， 江潔， 許加超， 等. 貽貝磷脂與大豆磷脂卵黃磷脂組成的比較研究［J］. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2002， 24（1）： 87-89.

［19］ 王琦. 海產(chǎn)動(dòng)物來源n-3 PUFA磷脂的提取及生物活性研究［D］. 青島： 中國(guó)海洋大學(xué)， 2008.

［20］ MAN D， PODOLAK M. Tin compounds interaction with membranes of egg lecithin liposmes［J］. Zeitschrift Fur Naturforschung， 2007， 62：427-432.

［21］ 張苓花， 葉淑紅， 王晨祥， 等. 酶法合成DHA/EPA型卵磷脂的研究［J］.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2000， 19（1）： 45-47.

［22］ 何俊婷. 多烯磷脂酰膽堿分離與制劑工藝研究［D］. 西安： 西北大學(xué)， 2011.

［23］ 劉艷青. 皺紋盤鮑地域及季節(jié)性差異分析及內(nèi)臟磷脂減肥活性研究［D］. 青島： 中國(guó)海洋大學(xué)， 2013.

［24］ 馬琴. 二十二碳六烯酸-磷脂生物活性的研究［D］. 青島： 中國(guó)海洋大學(xué)， 2009.

［25］ 胡世偉， 王靜鳳， 徐雷雷， 等. 海參磷脂型二十碳五烯酸降血糖作用機(jī)制的研究［J］. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)， 2013， 35（5）： 445-449.

Determination of Phospholipids in Channel Catfi sh Brain by High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector （HPLC-ELSD）

LU Hang， LI Hui， ZHAO Jinghua， HE Qinfeng， LI Jingjing， DING Yuning， YAN Ze， HU Jian'en*（College of Food Science and Engineering， Dalian Ocean University， Dalian116023， China）

In this paper， the phospholipids in the brain of channel catfi sh were extracted and purifi ed. A high-performance liquid chromatography equipped with an evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was used to analyze the phospholipid components. The results indicated that the content of phosphatidylcholine （PC） was the highest among the detected phospholipids phospholipids in channel catfish brain， which accounted for 45.73% of the total phospholipids，followed by phosphatidylethanolamine （PE）， which accounted for 17.39%. The proportions of phosphatidylserine （PS）and proporphosphatidylinositol （PI） in relative to the total phospholipids were 5.01% and 1.20%， respectively. Under optimized experimental conditions， the respective peak areas were fi nely fitted to a linear model within the indicated range， and each class of phospholipids was separated well. The method also can be applicable for the determination of phospholipids in other samples.

channel catfish brain； phospholipids； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）； quantitative analysis

TS254.9

A

1002-6630（2015）24-0177-04

10.7506/spkx1002-6630-201524032

2015-03-24

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2012257）

盧航（1982—），女，講師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ蟾碑a(chǎn)物利用。E-mail：luhang@dlou.edu.cn

胡建恩（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ蟾碑a(chǎn)物利用。E-mail：huje@dlou.edu.cn