中藥微生物轉(zhuǎn)化的研究

吳 思

（湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432100）

微生物轉(zhuǎn)化中藥是指利用微生物產(chǎn)生的酶系作用于中藥底物,以期產(chǎn)生新的活性成分,提高中藥藥效,降低中藥不良反應(yīng),去除中藥中的大分子雜質(zhì)和將其作為研究藥物代謝機制的輔助手段。由于其具有周期短、成本低、區(qū)域和立體選擇性強、反應(yīng)條件容易控制、對周圍環(huán)境影響小等特點,且能夠產(chǎn)生一些化學(xué)法難以生成的產(chǎn)物,因此近年來,微生物轉(zhuǎn)化方法已經(jīng)受到研究者的廣泛重視,并正迅速地發(fā)展。通過先導(dǎo)化合物經(jīng)生物轉(zhuǎn)化方法尋找新的高活性、低毒性的藥物已成為有效開發(fā)新藥的一條途徑。

微生物轉(zhuǎn)化中藥的本質(zhì)是利用微生物體系產(chǎn)生的酶對外源性中藥底物進(jìn)行結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程[1]。微生物轉(zhuǎn)化中藥具有以下特點：(1)微生物轉(zhuǎn)化酶系廣泛。微生物在生長過程中會產(chǎn)生多樣的酶系,如纖維素酶、木質(zhì)素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等,目前已發(fā)現(xiàn)了3000余種能催化各種化學(xué)反應(yīng)的酶[2]。微生物豐富而強大的酶系構(gòu)成了高效生物催化體系的核心,且微生物的酶系所催化的反應(yīng)很多是一些化學(xué)合成難以進(jìn)行的反應(yīng)。(2)反應(yīng)選擇性強。具體來講主要包括化學(xué)選擇性、非對映異構(gòu)體選擇性、區(qū)域選擇性、面選擇性、對映異構(gòu)體選擇性以及立體選擇性[3],同時微生物轉(zhuǎn)化修飾中藥底物某一基團時對不需要轉(zhuǎn)化的基團無需保護,顯示出極高的選擇性。(3)反應(yīng)條件溫和。由微生物所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)一般都在常溫、常壓下進(jìn)行,運行操作的設(shè)備也比較簡便,產(chǎn)生的公害少,一般不造成環(huán)境污染,后處理也很簡單。中藥底物在轉(zhuǎn)化過程中可以最大限度地保護中藥中活性成分免遭破壞,可有效解決中藥在煎、煮、蒸、浸等傳統(tǒng)工藝中活性成分難以最大限度提取的難題。(4)優(yōu)化條件可使轉(zhuǎn)化率提高。微生物轉(zhuǎn)化中藥底物的過程中易受到底物溶解度低,底物和產(chǎn)物抑制微生物酶活性和產(chǎn)物進(jìn)一步降解等影響。為了提高轉(zhuǎn)化率,可以從誘導(dǎo)物和底物的添加,表面活性劑的添加,碳源、氮源、無機鹽,微量元素和酶的抑制劑以及微生物細(xì)胞和酶的固定化,反應(yīng)體系等方面進(jìn)行選擇優(yōu)化。此外,微生物轉(zhuǎn)化中藥的反應(yīng)可以被看作微生物發(fā)酵過程,所以可以連續(xù)進(jìn)行。同時由于設(shè)備和原料簡單易得,生產(chǎn)成本較低,可進(jìn)行工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

很多菌種都能使多種化合物發(fā)生不同的反應(yīng),這些菌種主要是霉菌、酵母菌和細(xì)菌,其中又以霉菌在文獻(xiàn)中特別常見。微生物轉(zhuǎn)化主要涉及了羥基化、環(huán)氧化、脫氫、加氫、水解、酯化、脫水等各類化學(xué)反應(yīng),還有些代謝產(chǎn)物在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生了很復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng),人們可以通過這些反應(yīng)尋找新的有藥用價值的衍生物,也可以尋找使這些反應(yīng)發(fā)生的微生物的酶,進(jìn)而用于工業(yè)化生產(chǎn)。本文將從微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)類型展開討論，闡述微生物對中藥的生物轉(zhuǎn)化作用。

1 羥基化

20世紀(jì)50年代首次用黑根霉 (Rhizopus nigricans)將黃體酮轉(zhuǎn)化為11α-羥基黃體酮,使人們開始意識到微生物轉(zhuǎn)化在制藥工業(yè)中的重要性,從此微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥物工業(yè)生產(chǎn)中成為不可或缺的一種方法。羥基化是微生物轉(zhuǎn)化中最常見也最重要的一種反應(yīng),羥基化反應(yīng)可以發(fā)生在多個位置,生成多種有意義的衍生物。尤其是甾體藥物,特別是α位的羥基化產(chǎn)物,在甾體制藥工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。比如甾體的7α-羥基化衍生物可以用于利尿劑的生產(chǎn),但用化學(xué)方法合成很困難,文獻(xiàn)[4]報道利用菌種Botrytis cinerea使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7α-羥基衍生物,研究發(fā)現(xiàn)在不同孵化期轉(zhuǎn)化的甾體化合物不同，經(jīng)過5天的孵化主要代謝物是第7α-hydroxytestosterone（76%收益率），經(jīng)過6天的孵化主要代謝物是7α-羥基-17α-甲基睪酮（82%收益率），經(jīng)過6天（以及孵化后10天）的主要代謝產(chǎn)物是10β-羥基-19-去甲雄基-4-烯-3,17-二酮（78%收益率），經(jīng)過10天的孵化轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)品是14α-羥基-1-脫氫睪酮（68%收益率），經(jīng)過11天的孵化轉(zhuǎn)化的主要產(chǎn)品是7α-羥基-1-脫氫-17α-甲睪酮（52%收益率），可以看出，菌種Botrytis cinerea能夠非常有效地使睪丸激素等幾種甾體化合物生成7α-羥基衍生物，而且產(chǎn)量很高。

不僅是甾體化合物,其他化合物的羥基化代謝產(chǎn)物同樣具有重要的應(yīng)用意義。如ent-kaur 16-en-19-oic acid,一種二萜類化合物,具有刺激植物生長的活性。利用菌種Rhizopus stolonifer轉(zhuǎn)化此化合物,7d后產(chǎn)生2種代謝產(chǎn)物,其中一種產(chǎn)物也是7α位發(fā)生羥基化,該產(chǎn)物可以作為赤霉素生物合成和一種植物生長激素的中間體。

2 脫氫反應(yīng)

脫氫反應(yīng),一般主要是指化合物脫氫生成雙鍵。氯化孕酮醋酸酯(chlormadinone acetate),一種治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,文獻(xiàn)[5]用Arthrobacter simplex和Bacillus sphaericus這2種菌使其發(fā)生了脫氫反應(yīng)生成雙鍵,反應(yīng)所得產(chǎn)物為脫氫氯化孕酮醋酸酯(delmadinone acetate),這種產(chǎn)物不但和氯化孕酮醋酸酯一樣,是治療前列腺疾病的抗雄性激素藥品,還是合成乙酰環(huán)丙氯地孕酮(cyproterone acetate)的前體,而乙酰環(huán)丙氯地孕酮因為有抗雄性激素的活性而被廣泛的用作孕激素藥品,它可以避孕和治療前列腺癌。文中研究了利用單節(jié)桿菌

ATCC 6946和球形芽孢桿菌ATCC 13805自由和固定化細(xì)胞在液液兩相體系和脂質(zhì)體中對氯地孕酮醋酸酯的微生物轉(zhuǎn)化。對于液液兩相體系，正癸烷，正辛醇，氯仿和醋酸丁酯作為有機溶劑。脂質(zhì)體由氯地孕酮醋酸包埋在磷脂和膽固醇的脂質(zhì)體組成。對于這兩種生物催化劑固定化和自由懸浮，產(chǎn)量在水溶液中高于在液液兩相媒體。在所有情況下，水系統(tǒng)獲得的產(chǎn)量最高。在水介質(zhì)中，從單節(jié)桿菌懸浮液中3小時可以獲得48%的產(chǎn)率，從球形芽孢桿菌懸浮液中48小時可以獲得47%的產(chǎn)率。除了脫氫生成雙鍵,還有實驗發(fā)現(xiàn)[6],利用Rhodococcus erythropolis DCL14可以使香芹醇脫氫生成香芹酮。

3 支鏈的降解

利用微生物選擇性的使支鏈降解,可以得到有用的化合物中間體,這也是生物轉(zhuǎn)化在制藥及其他化工工業(yè)生產(chǎn)中的一大用處,具有非常廣闊的應(yīng)用前景。雄甾-4-烯-3,17-二酮 (4-AD)和雄甾1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)就是生產(chǎn)性激素等甾體藥物的重要中間體,利用菌種Mycobacterium sp.NRRL B-3683[7]即可將膽固醇側(cè)鏈降解生成這2種化合物。文獻(xiàn)[8]同樣都以氫化可的松作底物,用不同菌種卻得到相似的結(jié)果,2個實驗都出現(xiàn)了支鏈降解產(chǎn)物。文獻(xiàn)[9]的實驗中得到的2種支鏈降解產(chǎn)物,一種與文獻(xiàn)[8]得到的產(chǎn)物相同,而另一種則是前者產(chǎn)物的17位羥基變成了酮基。如果這2個菌種都可以選擇性的降解氫化可的松類似物的支鏈,將可能找到更多的所需的中間體。

4 酯化反應(yīng)和水解反應(yīng)

桉烷型化合物大部分都含有乙酸酯結(jié)構(gòu),在代謝過程中,雖然所用的菌種不同,但幾乎所有的底物都產(chǎn)生了酯基水解的代謝產(chǎn)物。而與水解反應(yīng)相對,作者也同樣發(fā)現(xiàn)乙酸酯化反應(yīng)也比較容易出現(xiàn)在代謝產(chǎn)物中[10]。在酯化反應(yīng)中,作者發(fā)現(xiàn)密葉辛木素(confertifolin),經(jīng)過轉(zhuǎn)化后生成2種代謝產(chǎn)物,其中主產(chǎn)物是3β-羥基化密葉辛木素,而另一種代謝產(chǎn)物則是3β-乙酸酯化密葉辛木素。很有可能這兩個產(chǎn)物是由一條代謝途徑來完成的,這一推測可能為合成有用的酯類化合物提供了捷徑。

5 環(huán)氧化

環(huán)氧化反應(yīng)在轉(zhuǎn)化的過程中也很普遍,多發(fā)生在化合物的雙鍵部位,尤其在萜類中常見,除環(huán)氧化反應(yīng),雙鍵部位也很容易形成鄰二醇結(jié)構(gòu),沒藥醇[11][(-)-α-bisabolol]一種單環(huán)倍半萜類化合物,它在Glomerella cingulata作用下生成的幾種代謝產(chǎn)物就是這一類反應(yīng)的典型代表。還有前面提到的ent-kaur-16-en-19-oicacid,其在培養(yǎng)15 d后又出現(xiàn)一種代謝產(chǎn)物ent-16β,17-dihydroxy-kauran-19-oic acid,這個代謝過程發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)使16,17位雙鍵生成為鄰二醇結(jié)構(gòu)。

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