山茱萸總苷的提取工藝及藥理研究

孫志明 門秀麗

（河北聯合大學基礎醫學院，河北 唐山063000）

中藥山茱萸為我國傳統名貴中藥，有補肝腎，澀精氣，固虛脫之功效[1]，具有降血糖、免疫調節、抗衰老、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗癌、抗艾滋病、不育癥和治療骨質疏松癥等藥理活性，其主要成分為環烯醚萜苷類、五環三萜酸及其酯類、鞣質類、揮發油類及多糖類等[2-4]。作為主要藥效部位的山茱萸總環烯醚萜苷包括馬錢苷（loganin）、莫諾苷（morroniside）、獐牙菜苷（sweroside）、獐芽菜苦苷（swertiamarin）、馬鞭草苷（verbenalin）、脫水莫諾苷元、山茱萸新苷（cornuside）等十余種，統稱為山茱萸總苷(Total glucosides from Cornus officinalis，TGC)。本文對山茱萸總苷的提取工藝、含量測定、藥動學、藥效學的研究進展進行綜述。

1 提取工藝

中藥苷類的提取一般采用含乙醇的水溶液提取，純化則采用大孔吸附樹脂富集的方法。

梁晉如等[5]采用星點設計-響應面法優化山茱萸總苷的提取及純化工藝。以乙醇濃度、液料比和提取時間為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及提取物得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進行多元線性回歸和二項式擬合，以響應面優選最佳的超聲提取工藝。以乙醇濃度、洗脫體積、上樣量為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及洗脫物得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進行多元線性回歸和二項式擬合，以響應面優選最佳的大孔樹脂純化工藝。確定提取工藝條件為乙醇濃度22%～25%，液料比12～15倍，提取時間30～40 min；純化工藝條件為乙醇濃度35%～45%，洗脫體積7～9 BV，上樣量40～50 mg/g。

不同型號的大孔樹脂對藥物的吸附程度不同。趙惠茹等[6]通過比較山茱萸總皂苷在9種不同型號大孔樹脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹脂，確定HPD-300型大孔樹脂具有良好的吸附與解吸性能，工藝參數為：上樣溶液質量濃度為0.5 g/mL，樹脂柱徑高比為1:7，吸附體積流量為2BV/h，每克干樹脂的最大吸附量為1.125g生藥。吸附飽和后，先用3 BV蒸餾水洗脫去除水溶性雜質，再用3.5 BV 50%乙醇進行解吸附，純化后的山茱萸總皂苷保留率和精制度分別為92.6%和394.5%。HPD-300型大孔樹脂可作為純化山茱萸總皂苷的較佳分離材料。

姬長新等[7]將山茱萸首先采用超高壓進行處理，然后將高壓處理后的山茱萸采用纖維素酶進行酶解提取，研究超高壓耦合纖維素酶處理對山茱萸得率的影響。結果表明，采用400MPa壓力處理3min，然后加入纖維素酶達到濃度1mg/mL，溫度55℃，pH4.5下酶解120min，山茱萸總皂甙的得率達到3.68%，是一種提取山茱萸總皂甙的新方法。

Liang J等采用高速逆流色譜法，選擇二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水-乙酸（5:5:3:4:0.1，v/v/v/v/v）組成的兩相溶劑系統，不到3h就從100mg山茱萸提取物中分離純化得到 7.9mg獐牙菜苷，13.1mg莫諾苷和10.2mg馬錢苷共三種環烯醚萜苷，純度分別為92.3，96.3和94.2%。

2 含量測定

中國藥典（2010版）規定以測定馬錢苷的含量來控制山茱萸藥材的質量，以乙腈-水(15：85)為流動相；檢測波長為240nm[1]。

李偉等建立反相高效液相色譜法測定山茱萸環烯醚萜總苷中馬錢苷和莫諾苷含量的方法，方法為Lichrosphere C18柱(4.6mm×150mm, 5μm)，流動相為乙腈-水梯度洗脫(0~12min，乙腈10%~55%)，檢測波長240nm。結果馬錢苷和莫諾苷分別在0.088~0.528μg（r=0.9998）和0.088~0.352μg（r=0.9995）之間線性良好，可以用于控制山茱萸環烯醚萜總苷的質量。

Cai H等建立HPLC串聯電噴霧電離質譜法同時測定山茱萸中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、7-O-甲基莫諾苷、山茱萸新苷和沒食子酸等八種成分的含量，采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式，Agilent Zorbax Extend C18色譜柱，可在 10min全部檢測完成，定量限 0.0042~ 12.7875ng/mL，平均回收率97.1~103.7%。

3 藥動學

中藥藥動學對闡明中藥的有效性、有效成分的作用機制、解釋中藥復方配伍的合理性及中醫的辨證施治等都有重要意義，同時還為新活性成分的發現、新藥合成及新的前體藥物的制備提供理論和實踐的依據。

山茱萸總苷中馬錢苷和莫諾苷的吸收、分布、代謝和排泄均有報道。如山茱萸注射液中馬錢苷和莫諾苷在小鼠體內藥物代謝動力學研究，馬錢苷和莫諾苷均符合二室模型，主要藥動學參數t1/2(α)，t1/2(β)，k21，k12，k10，V，AUC，CL分 別 為 3.2，25.1min，6.0，4.98，3.56/h，0.551L/kg，13.6mg·h/L，1.96 L/kg·h；3.6，21.5min，5.93，3.83，3.80/h，0.647L/kg，27.2mg·h/ L，2.46L/kg·h。組織分布方面，馬錢苷在腎中藥物濃度最高，其次在胃、肺、小腸等組織，腦組織中最少。大多數組織的藥物含量于給藥后90 min最高，然后逐漸下降。莫諾苷在小腸中藥物濃度最高，其次在腎和胃等組織，心、肝、肺和脾中濃度較低，腦組織中未檢測到莫諾苷。馬錢苷在大鼠體內的尿液排泄藥動學表明，24 h內馬錢苷原型藥物經尿排泄完全，排泄量主要集中在0~4 h，約占總排泄量的81.5%；莫諾苷在24h內原型藥物經尿排泄完全，排泄量主要集中在0~3 h，約占總排泄量的68.5%。馬錢苷可被腸道細菌酶水解生成苷元，苷元又進一步代謝轉化，生成代謝物Mlog-2，Mlog-2最終被排出體外。莫諾苷可被腸道細菌酶水解形成苷元，經環裂解，與NH3發生親核加成后環化及脫水縮合等步驟生成代謝物Mmor-1，苷元經環裂解，安息香縮合，與NH3發生親核加成后環化生成代謝物Mmor-2，Mmor-1和Mmor-2最終排出體外。

藥動學參數的處理方法除了傳統的3P97、DAS等以外，還可以采用BP神經網絡預測莫諾苷的藥動學參數。

4 藥效學

山茱萸總苷對糖尿病的作用。以高脂飼養結合STZ腹腔注射造模，于造模后2周分別灌胃給予降糖通脈膠囊、山茱萸總苷（0.05、0.1、0.2 g/kg）治療，連續16周。結果顯示應用山茱萸總苷后，糖尿病大鼠血糖降低，血清NO、NOS水平升高，血漿ET水平降低，心指數降低，心肌肥大程度減輕，對糖尿病心臟病變有一定的保護作用。郭潔等采用巨噬細胞和腎系膜細胞共培養體系，確定山茱萸環烯醚萜總苷顯著抑制晚期糖基化終末產物(AGEs)誘導的巨噬細胞遷移能力，不同劑量山茱萸環烯醚萜總苷(1.0、0.5、0.25 mg/mL)對巨噬細胞遷移抑制率分別為42.09%±7.25%、26.44%±10.23%、20.84%±6.84%；顯著抑制AGEs誘導的炎癥因子IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α的分泌水平；Western blot分析顯示山茱萸環烯醚萜總苷及AGEs受體特異性抗體顯著下調AGEs誘導的ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達。山茱萸環烯醚萜總苷可劑量依賴性地減輕AGEs誘導的大鼠腎系膜細胞HBZY-1炎癥反應，對糖尿病腎病的發生發展具有一定的保護作用。Ma W等研究表明山茱萸中的苷類抑制體外高糖培養HRMCs的IV型膠原抗體、纖維連接蛋白和IL－6。目前已經證實山茱萸總苷中的莫諾苷是降糖作用的主要有效成分。

山茱萸總苷有抗炎、免疫抑制作用。小鼠給予總苷2、1 g/kg劑量時能顯著地抑制NIH小鼠單核吞噬系統對剛果紅的廓清；1.00、0.50、0.25 g/kg以及4.0、2.0 g/kg各個劑量時能分別顯著抑制角叉菜膠所致小鼠及大鼠足爪腫脹；而在0.6、0.3 g/kg劑量時，能明顯抑制由弗氏完全佐劑誘導的關節炎所引起的注射局部的早期炎癥反應和12d后的再度腫脹，又明顯抑制另側后肢因遲發性超敏反應所引起的足腫脹。0.15 g/kg劑量時，連續給藥12 d后，表現出對再度腫脹及另側后肢腫脹的明顯抑制作用。證明了山茱萸總苷有良好的抗炎免疫作用。山茱萸總苷可以抑制T、B淋巴細胞增殖，抑制大鼠佐劑性關節炎的腹腔巨噬細胞產生TNFα、IL－1、IL－6等，具有免疫抑制作用。本研究結果表明山茱萸總苷可以明顯抑制rTNF－α和rIL－1誘導ECV304表達ICAM－1和CD44表達，并呈明顯的量－效關系，抑制血管內皮細胞的活化表達ICAM－1和CD44可能是山茱萸總苷的免疫抑制機理的分子基礎之一。孟晶等建立封閉群大鼠SD－Wistar組間同種異體穿透性角膜移植模型，觀察脾淋巴細胞對絲裂原刀豆蛋白A刺激的增殖反應和單向混合淋巴細胞反應提出抑制T淋巴細胞的增殖、混合淋巴細胞反應、T淋巴細胞活化表達CD分子，IL－2受體的表達是山茱萸總苷抑制機體細胞免疫功能的主要機制之一。

山茱萸總苷抑制細胞凋亡的作用。陳克芳等采用原代培養乳鼠的心肌細胞，液狀石蠟封閉法建立缺血缺氧模型，將原代培養3d的心肌細胞分為對照組、缺氧組(1h、2h、3h、5h)及治療組，藥物濃度為生藥10g/L，TUNEL法檢測各組的凋亡率結果顯示，與對照組相比，缺氧組各時間點凋亡率明顯上升 (P＜0.01)，與缺氧組比較，治療組各個時間點的凋亡率都有所下降(P＜0.01)，山茱萸總苷可以抑制心肌細胞的凋亡。Park CH等證實莫諾苷抑制肝細胞凋亡。

山茱萸總苷對阿爾采末病的作用。褚燕琦等以山茱萸環烯醚萜苷與人神經母細胞瘤細胞系SKNSH細胞預孵育24h，再用岡田酸10 nmol/L與SKNSH細胞共孵育6h，用Westernblot方法觀察磷酸化和非磷酸化tau蛋白表達，用間接免疫熒光法觀察神經細胞微管的變化。提示山茱萸環烯醚萜苷能夠抑制神經細胞tau蛋白過度磷酸化，保護細胞微管結構，因此可能具有治療Alzheimer病應用前景。

山茱萸總苷對腦梗死的作用。李林等將大鼠灌胃給予山茱萸提取物（主要成分為環烯醚萜苷）7d后，制作光化學致腦梗死模型，采用分光光度法檢測腦組織中NO和一氧化氮合酶（NOS）的變化，免疫組織化學方法檢測核轉錄因子κΒ陽性細胞數量的變化。結果顯示山茱萸環烯醚萜苷通過減小腦梗死面積，降低腦皮層NO含量和NOS活性，并顯著減少核轉錄因子κΒ陽性細胞數量發揮對腦梗死的治療作用。

山茱萸總苷促進坐骨神經損傷再生及修復。齊爽等將84只Balb/ c小鼠隨機分為山茱萸總苷高、中和低劑量組及生理鹽水對照組，各組分別于術后3天、5天、1周、2周、4周、8周時間點采用免疫組化法檢測L4～L6脊髓運動神經元內生長相關蛋白(Gap－43)表達；術后第4、8、12周行電生理檢查測定神經傳導速度(MCV)。結果顯示高、中劑量組Gap－43表達明顯多于低劑量和對照組(P＜0.05)，術后第4、8、12周高、中劑量組較低劑量組和對照組再生神經傳導速度加快、波幅升高、潛伏時縮短(P＜0.05)。山茱萸總苷能夠促進大鼠周圍神經損傷后MCV的恢復，其機制可能為增加損傷脊髓運動神經元中Gap－43的表達。

山茱萸總苷對干細胞的作用。人骨髓間充質干細胞(hMSCs)是一種被認為具有多種分化潛能的細胞，在特定條件下能夠分化為脂肪細胞、造骨細胞、肌腱細胞和造血基質細胞等多種細胞，用于細胞治療和基因治療，可能會成為治療Ⅰ型糖尿病的有效手段。Hu N等證實莫諾苷促進骨髓間充質干細胞(RMSC)增殖。

5 結語

山茱萸總苷在提取工藝、藥動學及藥效學方面的研究日漸成熟，我國山茱萸資源豐富，如果將山茱萸總苷設計成合理的劑型，研發療效確切的新藥，必將有著廣闊的臨床應用前景和生產前景，對開發我國中藥資源有著重要意義。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學工業出版社,2010:21.

［2］張亞軍,高云艷.山茱萸化學成分與藥理研究概況[J].中國中醫藥信息雜志, 2002,9(10):81－82.

［3］Ma W,Wang KJ,Cheng CS,et al.Bioactive compounds from Cornus officinalis fruits and their effects on diabetic nephropathy[J].Journal of ethnopharmacology, 2014,153(3):840－845.

［4］Kim JY,Kim YK,Choi MK,et al.Effect of Cornus Officinalis on Receptor Activator of Nuclear Factor－kappaB Ligand (RANKL)－induced Osteoclast Differentiation[J].Journal of bone and mineral metabolism,2012,19(2):121－127.

［5］梁晉如,張新新,朱砂.星點設計－響應面法優化山茱萸總苷的提取及純化工藝[J].藥物分析雜志,2013,33(6):1059－1066.

［6］趙惠茹,龍靜,楊黎彬,等.HPD－300大孔吸附樹脂對山茱萸總皂苷分離工藝的優化[J].中成藥,2014,36(2):416－419.

［7］姬長新,袁貴英,焦鐳,等.超高壓耦合酶解技術提取山茱萸總皂甙的研究[J].食品科技,2013,38(1):241－244.