有氧運(yùn)動對心肌梗死大鼠心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的影響

邵承穎等

摘 要：目的：探討8周有氧運(yùn)動對心肌梗死大鼠心臟交感重構(gòu)的影響及其機(jī)制。方法：42只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌梗死組、心肌梗死+有氧運(yùn)動組。結(jié)扎冠狀動脈左前降支制備大鼠心肌梗死的模型，術(shù)后1周心肌梗死+有氧運(yùn)動組成活大鼠進(jìn)行8周跑臺運(yùn)動。采用免疫組織化學(xué)方法觀察心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維分布及表達(dá)；采用western blot檢測心肌中NGF蛋白表達(dá)；采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測IL-1β及TNF-α mRNA表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組大鼠相比，心肌梗死組心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加（P<0.01），形態(tài)粗大且空間分布紊亂；NGF蛋白，IL-1β及TNF-α mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。有氧運(yùn)動干預(yù)后心肌組織神經(jīng)纖維密度明顯降低（P<0.01），形態(tài)更趨于正常；心肌中NGF、IL-1β及TNF-α表達(dá)顯著下降。結(jié)論：有氧運(yùn)動減少心肌梗死后心肌局部炎癥反應(yīng)，下調(diào)梗死灶周組織NGF表達(dá)，抑制交感神經(jīng)過度再生，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)。

關(guān)鍵詞：有氧運(yùn)動；心肌梗死；神經(jīng)重構(gòu)；炎癥

中圖分類號：G804.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-2076（2015）03-0073-05

Abstract：Objective：To investigate the role of aerobic exercise in ameliorating sympathetic sprouting after myocardial infarction （MI） in rat hearts.Methods： 42 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into three groups： sham group， MI and MI with aerobic exercise （MI+ME） group. An MI model was induced by ligation of the coronary artery； the rats in MI+ME group were assigned to 8 weeks of exercise. Immunohistochemistry was used to measure the density of nerve fibers positive for growth-associated protein 43 （GAP43） and tyrosine hydroxylase （TH）. The protein levels of nerve growth factor （NGF） were detected by western blot analysis. The mRNA levels of interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were examined by quantitative real-time PCR.Results：Compared with the sham-operated hearts， MI increased the density of[HK][HT]

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年雄性SD大鼠42 只，體重250-280g（購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心）。Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；Real-time RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程公司，引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成；抗酪氨酸羥化酶（TH）抗體購于美國Millipore公司，抗生長相關(guān)蛋白43（GAP43）抗體購于英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗綿羊二抗購于美國PKL公司，抗NGF抗體購于美國Epitomics公司，抗GAPDH抗體購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌梗死模型制備

SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、單純心肌梗死組（心肌梗死組）以及心肌梗死+有氧運(yùn)動組（有氧運(yùn)動組），每組14只。利用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制備大鼠心肌梗死的模型[7]，所有動物用10% 水合氯醛溶液0.3 mL/100g腹腔注射麻醉，氣管插管，小動物呼吸機(jī)通氣。于大鼠胸骨左側(cè)3-4肋間開胸，結(jié)扎左前降支，以心電圖aVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高 0.2 mV作為手術(shù)成功標(biāo)志，隨后逐層關(guān)胸。假手術(shù)組大鼠作為對照，只開胸穿線，不結(jié)扎。

有氧運(yùn)動組大鼠手術(shù)恢復(fù)1周后參照Kemi OJ[8]的運(yùn)動方案進(jìn)行訓(xùn)練：動物跑臺運(yùn)動速度為15 m/min，大鼠進(jìn)行適應(yīng)運(yùn)動10 min；將跑臺運(yùn)動速度增至20 m/min，持續(xù)運(yùn)動50 min。大鼠運(yùn)動60 min/d，5次/周，共計(jì)8周。假手術(shù)組及心肌梗死組正常籠內(nèi)喂養(yǎng)不運(yùn)動。

1.2.2 心肌標(biāo)本處理

實(shí)驗(yàn)大鼠8周有氧運(yùn)動干預(yù)后，所有成活大鼠再次麻醉并迅速取下心臟，經(jīng)主動脈灌注生理鹽水清除殘存血液。取梗死灶周（梗死蒼白邊緣3 mm以內(nèi)）心肌組織，假手術(shù)組取相應(yīng)部分心肌組織，分別存放于中性甲醛及液氮中保存。

1.2.3 GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維密度測定

取甲醛固定后的心肌組織，石蠟包埋，切片，片厚4 μm，常規(guī)脫蠟、高壓修復(fù)后加一抗4℃過夜，二抗37℃孵育30 min，DAB顯色，復(fù)染后封片。參照Cao等[9]的方法，選取神經(jīng)分布較為密集的區(qū)域?qū)ι窠?jīng)纖維密度進(jìn)行分析：采用Image Pro Plus5圖像處理分析軟件定量分析GAP43及TH陽性神經(jīng)纖維在所選區(qū)域中所占面積（以μm2/mm2表示），取其平均值作為陽性神經(jīng)纖維密度值。

1.2.4 心肌中NGF蛋白表達(dá)

將心肌組織切成細(xì)小碎片，每100 mg 組織加1 mL心肌組織裂解液冰上勻漿，提取蛋白。用12%分離膠、5%濃縮膠100 V電泳60 min，160 V恒壓電轉(zhuǎn)60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后加一抗（1[JX-*4]：[JX*4]500），4°C過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1[JX-*4]：[JX*4]10000）室溫孵育1 h。ECL發(fā)光液顯影，Image J圖像處理軟件，以內(nèi)參GAPDH蛋白條帶光密度值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.5 IL-1β及TNF-α mRNA表達(dá)

[JP3]根據(jù)Trizol試劑盒提供的方法提取心肌組織總mRNA。按照real-time RT-PCR試劑盒的方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。引物序列：IL-1β，上游 5-AGT GGC AAT GAA AAT GAC CTG-3，下游 5-CAC AAC GAC TGA CAA GAC CTG-3；TNF-α，上游5-CTG CCT CAG CCT CTT CTC TTT-3，下游 5-CAC TTG CGG GTT TGC TAC TAC-3；GAPDH，上游5-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3，下游5-TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT-3。GAPDH作為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。[JP]

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（[AKx-]±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，然后采用最小顯著差異法進(jìn)行組間兩兩比較。P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況

結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支后數(shù)分鐘后可發(fā)現(xiàn)結(jié)扎動脈供血區(qū)域心肌顏色呈暗紅色，搏動減弱，與非梗死區(qū)分界明顯。8周有氧運(yùn)動結(jié)束后，假手術(shù)組無死亡，共14例大鼠完成實(shí)驗(yàn)；心肌梗死組有4例死亡，共10例大鼠完成實(shí)驗(yàn)；有氧運(yùn)動組有2例死亡，共12例大鼠完成實(shí)驗(yàn)。

2.2 心肌中GAP43、TH陽性神經(jīng)纖維分布及表達(dá)

假手術(shù)組GAP43陽性神經(jīng)纖維少見或缺如，呈點(diǎn)狀分布；心肌梗死組梗死灶周處心肌中GAP43陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，分布密集且形態(tài)粗大；與心肌梗死組相比，有氧運(yùn)動組心肌組織的GAP43陽性神經(jīng)纖維密度明顯減少（P<0.01），分布較為稀疏（圖1A，表1）。

假手術(shù)組TH陽性神經(jīng)纖維在心肌組織中均勻分布，沿心肌纖維縱行分布；心肌梗死組TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，空間分布紊亂，形態(tài)異常，部分聚集成束，偶可相互交錯(cuò)呈網(wǎng)狀；與心肌梗死組相比，有氧運(yùn)動組TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯降低（P<0.01），且形態(tài)更趨于正常化，未發(fā)現(xiàn)粗大、密集的神經(jīng)纖維束。（圖1B，表1）。

3 討論

正常生理情況下，交感神經(jīng)以其“固有”形式分布于心臟，但在某些心臟病變情況下，其支配形式也會發(fā)生改變，繼而引起功能學(xué)的改變。心肌缺血可引起心臟去神經(jīng)支配、神經(jīng)再生、交感神經(jīng)過度支配，即交感神經(jīng)重構(gòu)這一系列動態(tài)改變。這種心臟交感神經(jīng)的異常支配加重了MI后心肌的電生理異質(zhì)性及不穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致室性心律失常易感性增加[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取GAP43及TH作為神經(jīng)標(biāo)記物研究MI后交感神經(jīng)再生現(xiàn)象。與既往研究結(jié)果一致[9-10]，我們的研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死灶周GAP43及TH陽性神經(jīng)纖維密度明顯增加，且空間分布紊亂，形態(tài)異常，部分聚集成束，偶可相互交錯(cuò)呈網(wǎng)狀。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MI可導(dǎo)致梗死灶周組織不同程度的交感神經(jīng)再生及紊亂的交感神經(jīng)支配，即交感神經(jīng)重構(gòu)。

NGF，作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的代表，對交感神經(jīng)的生長、延伸、突觸功能調(diào)控都有重要作用。NGF與靶細(xì)胞上TrkA或p75NTR受體結(jié)合，啟動下游MAPK/ERK通路，進(jìn)而促進(jìn)交感神經(jīng)生長及軸突延伸[11]。多項(xiàng)研究證實(shí)，MI后心肌局部NGF表達(dá)明顯上調(diào)，且NGF在時(shí)間-空間的動態(tài)表達(dá)變化與交感神經(jīng)密度呈正相關(guān)[3，10，12]。隨著研究的進(jìn)一步深入，炎癥反應(yīng)與交感神經(jīng)再生的關(guān)系逐漸引起科研人員的關(guān)注。梗死心肌組織周圍的巨噬細(xì)胞可合成并分泌大量NGF[3-4]；此外，IL-1β、TNF-α等炎癥因子也可通過多種途徑上調(diào)NGF及其受體p75NTR的表達(dá)[13]，從而促進(jìn)交感神經(jīng)軸突延伸、生長，并導(dǎo)致交感神經(jīng)過度增生及重構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選取IL-1β、TNF-α作為炎癥指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)心肌梗死后心肌中IL-1β、TNF-α相應(yīng)的mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，同時(shí)NGF含量也顯著增加，我們的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)MI后NGF表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，炎癥反應(yīng)的程度直接影響著心肌梗死后心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的過程。

近年來，有氧運(yùn)動被認(rèn)為是多種心血管疾病的有效治療及康復(fù)手段。業(yè)已證實(shí)，MI早期適宜強(qiáng)度的有氧運(yùn)動可通過逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)[14]、增加每搏輸出量及射血分?jǐn)?shù)[15]、改善左室收縮功能[16]等發(fā)揮心臟保護(hù)作用。此外，一系列臨床研究表明，長期有氧運(yùn)動可降低心臟交感神經(jīng)張力，從而減少室性心律失常的發(fā)生[17-18]；Hautala等[19]在校正受試者年齡、訓(xùn)練時(shí)間等因素后發(fā)現(xiàn)，每周進(jìn)行3次30 min預(yù)計(jì)最大心率60%至80%強(qiáng)度范圍的有氧運(yùn)動，并持續(xù)四周以上，可顯著增強(qiáng)心臟迷走神經(jīng)張力。但目前關(guān)于有氧運(yùn)動調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)支配平衡的機(jī)制尚無分子學(xué)方面的合理解釋。Adamopoulos等[20]的研究表明，有氧運(yùn)動可減少心衰患者外周血液中的炎癥因子的表達(dá)，且有氧運(yùn)動對心臟的保護(hù)作用與其抗炎作用密切相關(guān)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將“有氧運(yùn)動—炎癥—NGF—神經(jīng)再生”為研究主線，結(jié)果顯示，8周有氧運(yùn)動可顯著下調(diào)心肌中IL-1β、TNF-α的水平，降低心肌中NGF表達(dá)并有效改善MI后心臟交感神經(jīng)再生及重構(gòu)。因此，我們認(rèn)為，有氧運(yùn)動可通過減輕心肌局部炎癥反應(yīng)以抑制心臟交感神經(jīng)過度再生，這也可能是有氧運(yùn)動降低交感神經(jīng)張力、增強(qiáng)迷走神經(jīng)張力的可能機(jī)制之一。此外，有研究證實(shí)，迷走神經(jīng)興奮釋放的乙酰膽堿可作用于諸多炎癥細(xì)胞上的α7煙堿型乙酰膽堿受體，激活JAK2/STAT3通路，抑制促炎因子釋放，從而發(fā)揮“迷走神經(jīng)抗炎作用”[21]。在本實(shí)驗(yàn)中我們尚無法明確有氧運(yùn)動是直接抑制炎癥反應(yīng)，抑或通過興奮迷走神經(jīng)間接抑制炎癥反應(yīng)，但我們的研究已初步證實(shí)有氧運(yùn)動可通過減輕MI后心臟炎癥反應(yīng)，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)，該研究結(jié)果也為有氧運(yùn)動對心肌梗死后心源性猝死的有效防治提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

8周有氧運(yùn)動可減輕心肌梗死后心肌局部炎癥反應(yīng)，下調(diào)梗死灶周組織NGF表達(dá)，抑制交感神經(jīng)過度再生，從而改善心肌梗死后交感神經(jīng)重構(gòu)。

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