20株木腐菌高產漆酶菌株的篩選

劉卉娟等

摘要：采用PDA-苯胺藍顯示法檢測了20株木腐菌的產漆酶特性，初篩選出8株產漆酶菌株，通過液體發酵培養進一步檢測其漆酶活性。結果顯示，能夠產生漆酶的菌株中只有6株檢測到漆酶活性，其中SWFC9938產漆酶能力最強，最高平均酶活性可達1 656.82 U/mL，為高產漆酶菌株。Cu2+和藜蘆醇誘導能顯著提高SWFC9938的產酶能力，最高平均酶活性分別可達2 485.10和2 454.24 U/mL。藜蘆醇能明顯縮短最高產酶的發酵時間，發酵8 d時即出現酶活性高峰（對照出現在12 d以后），藜蘆醇對SWFC9938菌株具有很好的誘導產酶活性。

關鍵詞：木腐菌；漆酶；菌株篩選；誘導培養

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2858-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.012

The Screening on the High Production of Laccase from 20 Wood-rotting Fungi

LIU Hui-Juan，AO Xin-yu，HONG Hai-di，YANG Yan-xian，CHEN Yu-hui

（College Of Life Science， Southwest Forestry University， Kunming 650224， Yunnan，China）

Abstract： Used PDA-aniline blue display method to detect the 20 strains producing laccase properties of wood rotting fungi，selected 8 strains producing laccase strains and developed further testing the laccase activity by liquid fermentation. The results showed that，the crude laccase which liquid fermentation among six potential strains exhibited high catalytic activity and the highest laccase activity approximated 1 656.82 U/mL for SWFC 9938. It was found that copper and veratryl alcohol were the best laccase inducers for strain SWFC 9938 with 2 485.10 U/mL and 2 454.24 U/mL respectively. Veratryl alcohol could obviously shorten the fermentation time of the maximum enzyme production，the maximum laccase activity appeared at 8 days cultivation （the maximum laccase activity of control material was at 12 days cultivation）， indicating that veratryl alcohol might be laccase-induced potential.

Key words： wood rotting fungi；laccase；strains screening；induction training

木質素是一種以苯丙烷為基本結構單元構成的芳香族高分子化合物，為植物主要組成成分之一。木質素在植物組織中與半纖維素以共價鍵形式結合，將纖維素分子包埋其中，形成一種堅固的天然屏障，使一般微生物及其酶很難侵染和進入，從而導致木質素的降解成為地球生物圈中碳素循環的主要障礙[1]。自然界參與降解木質素的微生物有真菌、放線菌和細菌等，但已知的惟一能廣泛降解木質素的生物是真菌[2]。因此從真菌中篩選高產木質素降解酶的菌株對實現木質素的降解具有重要意義。木質素降解需要木質素降解酶，木質素降解酶有3種，即木質素過氧化物酶（Lip）、錳依賴性過氧化物酶（Mnp）和漆酶（Laccase）[3]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶（EC1.10.3.2），廣泛存在于真菌中。由于漆酶作用底物廣泛，包括酚及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾體激素和生物色素、金屬有機化合物等。因此被廣泛應用于木質素降解、生物制漿與漂白、染料脫色、含酚廢水檢測及處理、生物傳感等方面[4]。漆酶降解木質素流程簡單，不需要H2O2和其他次級代謝產物的參與，克服了H2O2極易分解的難題，具有更大的實際應用價值[5]，因此受到廣泛關注。

本研究對采自云南、廣西、江西、浙江等地的20株隸屬于12個屬的木腐菌進行篩選，旨在了解其產酶特性并從中獲得高產漆酶菌株，為其開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

20株供試菌株由西南林業大學提供，菌株的種類及來源分別為：裂褶菌（Schizophyllum commune），編號SWFC9967，采自云南西雙版納。齒貝栓菌（Trametes cervina），編號SWFC10288，采自云南大理。彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），編號SWFC8557；毛栓菌（Trametes hirsuta），編號SWFC8755；褐蝶（Polystictus pterygodes），編號SWFC9215，采自云南思茅。白囊孔菌（Hirschioporus lacteus），編號SWFC8298；煙色血革菌（Haematostereum gausapatum），編號SWFC8345；粗毛韌革菌（Stereum hirsutum），編號SWFC8751，采自云南昆明。厚血革菌（Haematostereum australe），編號SWFC11058；紅緣擬層孔菌（Fomitopsis pinicola），編號SWFC11177；裂褶菌（Schizophyllum commune），編號SWFC11392a；軟線囊孔菌（Hirschioporus vellereus），編號SWFC11396；裂擬迷孔菌（Daedaleopsis confragosa），編號SWFC11431；木蹄層孔菌（Fomes fomentarius），編號SWFC11453；褐蓋韌革菌（Stereum vibrans），編號SWFC11696；薄刷革菌（Stereum radiatofissum），編號SWFC11667，采自云南麗江。彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），編號SWFC9938，采自廣西南寧。黑殼針層孔菌（Phellinus rhabarinus），編號SWFC10046，采自廣西上思。血紅密孔菌（Pycnoporus sanguieues），編號SWFC11044，采自江西玉山。絨毛栓菌（Tramets pubescens），編號SWFC11160，采自浙江杭州。

1.2 培養基

1.2.1 活化培養基 選擇PDA培養基用作活化培養基。

1.2.2 篩選培養基 在PDA培養基中按0.1 g/L的比例加入苯胺藍，制備成PDA-苯胺藍培養基[6]，用作篩選培養基。

1.2.3 液體發酵培養基 采用PD培養基為基本培養基，分別加入20 mg/L CuSO4·5H2O和2 mmol/L藜蘆醇構成Cu2+誘導培養基和藜蘆醇誘導培養基。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌株的活化培養 從存放于4 ℃冰箱的試管中挑出供試菌株，接種于PDA培養基上，在（28±2） ℃條件下培養至菌落長滿培養皿備用。

1.3.2 產漆酶菌株初篩 采用PDA-苯胺藍顯色試驗進行菌株產漆酶初篩[7]。用12 mm無菌打孔器切取PDA平板上培養好的菌落，接種至PDA-苯胺藍平板上并置于（28±2） ℃條件下培養10 d，每天定時觀察記錄菌落周圍有無變色現象產生，有記為“+”，無記為“-”。最后根據所產棕色氧化圈的大小，初步篩選出產漆酶的菌株。每一菌株設3個重復。

1.4 產漆酶菌株的復篩

1.4.1 粗酶液的制備 將初篩獲得的產漆酶菌株采用PDA平板培養， 待長滿平板后，用12 mm的無菌打孔器切取培養皿外圈的菌落，分別接入PD和誘導培養基中，每瓶接種3個菌片， 于（28±2） ℃、130 r/min條件下振蕩培養16 d并從第4天開始每間隔2 d取樣1次。培養液經8層紗布過濾，4 ℃、 6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液[8]。

1.4.2 漆酶活性測定 采用 ABTS[2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽]法測定粗酶液中漆酶的活性[9]。在含0.5 mmol/L ABTS的0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.0） 2 mL中，加入1 mL酶液后啟動反應，在420 nm波長下測定反應的前3 min內反應液的吸光度變化。以1 mL酶液加0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.0）2 mL做空白對照。以每分鐘使 1 μmol/L ABTS被轉化所需的酶量為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 初篩結果

20株木腐菌在PDA-苯胺藍顯色平板上培養時培養基的顏色變化的結果如表1所示。由表1可知，20個供試菌株中，有12個菌株在整個培養過程中培養基顏色始終保持不變，表明這些菌株在漆酶初篩培養基（PDA-苯胺藍）上生長時不能產生漆酶。另有8個菌株在漆酶初篩培養基上生長至第2天時菌落周圍的培養基的顏色便開始出現了變化，并隨著培養時間的延長，培養基上出現明顯的棕色氧化圈且氧化圈逐漸增大，表明這些菌株在漆酶初篩培養基上生長時能夠產生漆酶，為產漆酶菌株。8個產漆酶菌株分別為SWFC8557、SWFC8755、SWFC 9938、SWFC10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWF

C11396和SWFC11431。

2.2 復篩結果

2.2.1 8株產漆酶菌株在基本培養基中培養時產漆酶的能力 對初篩獲得的8株產漆酶木腐菌菌株進行復篩，采用液體發酵的方法進行篩選，結果如表2所示。由表2可知，8株供試菌株在基本培養基發酵培養條件下，不同菌株產漆酶能力存在很大差異。8株菌株中有2株菌株（SWFC11160和SWFC11431）在整個培養過程中發酵液僅檢測到微弱的漆酶活性，而其他6株菌在培養過程中檢測到較強的漆酶活性，但不同菌株所產漆酶活性的大小和出現酶活性高峰的時間存在明顯差異。6株菌株中在不同培養時間內產漆酶能力最強的菌株為SWFC 9938，其最大平均酶活性超過1 600 U/mL（12 d和14 d），其次為SWFC8557和SWFC11392a菌株，其最大平均酶活性分別達到935.99（16 d）和694.59 U/mL（14 d）。而菌株SWFC8755和SWFC11396產漆酶能力則相對較差，其最高平均酶活性僅分別達到48.33和63.78 U/mL，但產酶高峰出現較早，均出現在培養的第6天，隨后酶活性則逐漸下降，其中以SWFC11396菌株尤為明顯。

2.2.2 誘導劑（Cu2+誘和藜蘆醇）對8株木腐菌產漆酶的影響 采用Cu2+誘導培養基和藜蘆醇誘導培養基對初篩獲得的8株產漆酶木腐菌進行液體發酵培養，通過測定發酵液中漆酶活性以考察誘導劑Cu2+和藜蘆醇對供試菌株產漆酶的影響，結果如表3和表4所示。由表3和表4可知，兩種誘導劑對不同菌株產漆酶的影響不同。Cu2+和藜蘆醇不能對在基礎培養基（對照）中幾乎不產漆酶的菌株SWFC 11160和SWFC11431產生影響，即兩種誘導劑均不能誘導其產生漆酶，但卻能對在基礎培養基中能夠產漆酶的菌株的產酶能力造成不同程度的影響。Cu2+對產酶較弱的SWFC11396菌株的產漆酶能力影響不大，并在一定程度上抑制了SWFC8755菌株的產酶能力，而藜蘆醇則可提高SWFC8755菌株的產酶能力，但卻抑制SWFC11396的產酶能力。

兩種誘導劑對產漆酶能力相對較好的3株菌株（SWFC11392a、SWFC8557和 SWFC10288）產酶的影響主要表現為可縮短酶活高峰出現的時間，一般可縮短4～6 d，同時兩種誘導劑對酶活性的影響則表現出Cu2+的誘導活性高于藜蘆醇的誘導活性（圖1，圖2和圖3）。在6株液體發酵產漆酶菌株中，受兩種誘導劑影響最大的是產漆酶能力最強的SWFC9938菌株，兩種誘導劑均能提高其產漆酶能力（圖4）。在培養的前12 d內，Cu2+對其產漆酶的影響不大，漆酶活性與對照相比差異較小，但當培養時間超過12 d后，漆酶活性迅速升高，最高平均酶活達到2 485.10 U/mL（16 d），較對照最高平均酶活（1 656.82 U/mL）提高了50%；而藜蘆醇則在整個培養過程中漆酶活性均高于對照且酶活高峰前移，在培養的前8 d酶活性升高迅速，第8天時達到酶活高峰（對照酶活高峰出現在第12天），漆酶活性達到2 454.24 U/mL，較對照第8天時的平均酶活（849.47 U/mL）提高了189%。

3 小結與討論

對20株木腐菌首先采用PDA-苯胺藍篩選平板進行初篩，結果顯示有8個菌株能夠產生漆酶，分別為SWFC8557、SWFC8755、SWFC9938、SWFC 10288、SWFC11160、SWFC11392a、SWFC11396和

SWFC11431。采用液體發酵培養時，無論有無誘導劑存在均只在6株菌的發酵液中檢測到漆酶活性，其中漆酶活性最高的為SWFC9938，為高產漆酶菌株；其次為SWFC8557和SWFC11392a。6株產漆酶菌株的產酶能力大小為：SWFC9938>SWFC11392a、SWFC8557>SWFC10288>SWFC11396、SWFC8755>SWFC11431、SWFC11160。

Cu2+和藜蘆醇是常用的木質素降解酶誘導劑，研究結果顯示，兩種誘導劑對產漆酶菌株的產酶誘導活性存在一定差異。相比而言，Cu2+的誘導活性普遍高于藜蘆醇的誘導活性，而藜蘆醇誘導幾乎都能使產酶高峰提前，不同菌株的最適誘導劑存在差異。

本研究篩選獲得的SWFC9938菌株的產漆酶能力遠遠超過其他菌株，且在兩種誘導培養條件下產酶能力明顯提高，其中以藜蘆醇的誘導作用最好，培養8 d時產酶量便可達到最大，酶活性達到2 454.24 U/mL。藜蘆醇可明顯縮短SWFC9938產酶發酵時間，是一種較為理想的誘導劑。

同種不同來源的木腐菌在人工培養條件下產漆酶能力存在很大差異。SWFC8557和SWFC9938同為彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor），而SWFC9967和SWFC11392a則同為裂褶菌（Schizophyllum commune），但其來源地不同，產漆酶的能力也明顯不同。SWFC9938在人工培養條件下的產漆酶能力遠高于SWFC8557，而SWFC11392a在人工培養條件下具有產漆酶能力，但SWFC9967則無產漆酶能力。所以對不同來源的同種木腐菌進行篩選是非常必要的，而究竟是什么原因導致出現產酶能力的差異值得進一步深入研究。

本研究中的高產漆酶菌株SWFC9938為彩絨革蓋菌，屬于白腐菌的一種。白腐菌具有特殊的代謝類型及獨有的細胞外降解特性，能降解各種生物難降解的有機污染物而成為近年來國內外研究的熱點[10]。由于白腐菌是漆酶的主要產生菌，因此從自然界白腐菌中篩選新的高性能產酶菌株是解決漆酶資源短缺的一條重要途徑[11-13]。然而真正在自然生長條件下具有很高漆酶活性產量的菌株并不多，能夠篩選到優良自然突變體的機會也更小[14]，這就增加了菌種篩選的難度。郭梅等[15]研究發現彩絨革蓋菌是產漆酶的菌株。Youn等[16]在研究白腐菌產漆酶在木質素降解中的作用時，也證實彩絨革蓋菌是漆酶的高產菌。由于菌種不同來源的差異，各個菌株之間營養條件和生長條件有所不同，產生漆酶的能力也不同，有關SWFC9938菌株在人工培養下的最佳產酶條件尚有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 張 晶，黃民生，徐亞同.白腐真菌木質素降解酶的研究及應用進展[J].凈水技術，2004，23（1）：19-29.

[2] 陳素華.白腐真菌的木質素降解酶[J].生物學通報，2005，40（8）：26-27.

[3] 趙 敏，錢 程.白腐菌木素氧化酶系的檢測及其漆酶誘導產生的研究[J].中國造紙學報，2005，20（2）：101-105.

[4] 方 華，黃 俊，陳 瞾，等.白腐菌分泌漆酶的培養條件研究[J].化學與生物工程，2008，25（8）：30-33.

[5] 曾 濤，陳漢清，曾會才.木質素酶及其生產菌的篩選育種[J]. 基因組學與應用生物學，2009，28（3）：578-582.

[6] 宋安東，周利霞，胡 渝，等.產木質素降解酶類香菇菌株的篩選[J].河南農業大學學報，2006，40（3）：307-310.

[7] 杜海萍，宋瑞清，王鈺祺.幾種真菌產木質素降解酶的比較研究[J].林業科技，2006，31（4）：20-24.

[8] 郭偉云，姚朝陽，邵 強，等.云芝產漆酶發酵條件的研究[J]. 河北師范大學學報，2006，30（6）：716-720.

[9] 燕 紅，蘇 俊，于彩蓮，等.高效木質素降解菌株的分離篩選[J].浙江大學學報（農業與生命科學版），2011，37（3）：259-262.

[10] 黃丹蓮，曾光明，黃國和，等.白腐菌的研究現狀及其在堆肥中的應用展望[J].微生物學通報，2004，31（2）：112-115.

[11] KRAMER K J，KANOST M R，HOPKINS T L，et al.Oxidative conjugation of catechols with proteins in insect skeletal systems[J]. Tetrahedron，2001，57（2）：385-392.

[12] HOPKINS T L，KRAMER K J. Insect cuticle sclerotization[J]. Annu Rev Entomol，1992，37：273-302.

[13] BUMPUS J A，TIEN M，WRIGHT D，et al.Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungi[J].Sci， 1985，228（4706）：1434-1436.

[14] 黃乾明.漆酶高產菌株的誘變選育及其酶的分離純化、性質和基因克隆研究[D].四川雅安：四川農業大學，2005.

[15] 郭 梅，蒲 軍，梁 鵬，等.白腐菌Trametes versicolor產漆酶發酵條件的優化[J].食品研究與開發，2006，27（6）：9-12.

[16] YOUN H D，HAH Y C，KANG S.Role of laccase in lignin degradation by white-rot fungi[J]. Fems Microbiology Letters， 1995，132（3）：183-188.