血塞通分散片指紋圖譜研究

段紅吉，張 洪，來(lái)國(guó)防，楊光梅

（1.云南植物藥業(yè)有限公司，云南 昆明650109；2.云南省食品藥品檢驗(yàn)所，云南 昆明650011）

血塞通分散片主要成分是從三七中提取的三七總皂苷和相應(yīng)量輔料，精制而成（規(guī)格：50mg/片）。血塞通分散片主要成分為三七總皂苷（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd）[1-2]。

血塞通分散片主要用于散瘀止血，消腫定痛；用于咯血，吐血，便血，崩漏，外傷出血，胸腹刺痛，跌撲腫痛，能活血化瘀、止痛。血塞通分散片能抑制由ADP 引起的家兔血小板聚集，擴(kuò)張腦血管，使腦血流量增加，也具有抗血栓和抗凝血作用[3]。

指紋圖譜是評(píng)價(jià)中藥及其制劑質(zhì)量穩(wěn)定的有效方法，通過(guò)多成分的特征峰及多維的數(shù)據(jù)角度進(jìn)行綜合分析揭示血塞通分散片的指紋圖譜特征[4-6]，為血塞通分散片的質(zhì)量控制提供新的參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血塞通分散片（10 批批號(hào)分別為：20150501、20150502、20150503、20150601、20150602、20150603、20150605、20150606、20150607、20150608），樣品由云南植物藥業(yè)有限公司提供。

三七總皂苷對(duì)照品（含三七皂苷R16.9%、人參皂苷Rg128%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rb129.7%、人參皂苷Rd 7.3%），購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110870-201002。純化水為屈臣氏純化水；乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260 液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器），Chem－Station 工作站（Agilent 科技有限公司），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱作為分析柱[7-8]。

1.3 對(duì)照品與供試品制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備

取三七總皂苷對(duì)照提取物適量，精密稱定，加70%甲醇使溶解，并稀釋制成每1mL 含2.5mg 的溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液的制備

本制劑為三七總皂苷加適量賦形劑制成的片劑。因《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版一部“三七”項(xiàng)藥材中皂苷類成分含量測(cè)定時(shí)選用甲醇為提取溶劑，“三七總皂苷”項(xiàng)提取物指紋圖譜時(shí)選用70%甲醇為提取溶劑，且本制劑中多數(shù)輔料在乙醇中不易溶解，故選擇此3 種溶劑進(jìn)行提取考察。即：取重量差異項(xiàng)下的同一批次樣品，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25mg）3 份，各置10mL 量瓶中，分別精密加入甲醇、乙醇、70%甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）20min，放冷，再稱定重量，并用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失的重量，作為供試品溶液。同時(shí)，考察了3 個(gè)不同提取時(shí)間對(duì)本品指紋圖譜的影響。即：取重量差異項(xiàng)下的同一批次樣品，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25mg）3 份，各置10mL 量瓶中，加入甲醇至刻度，稱定重量，分別超聲提?。üβ?50W，頻率33kHz）10，20，30min 后，放冷，再稱定重量，并用甲醇補(bǔ)足減失的重量，作為供試品溶液。按1.4 項(xiàng)的色譜條件，分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，測(cè)定其相似度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取因素考察

結(jié)果表明3 種提取溶劑及提取時(shí)間，對(duì)圖譜無(wú)明顯影響。故選擇70%甲醇為提取溶劑，超聲時(shí)間為10min，并將此條件列入正文。

1.3.3 陰性對(duì)照溶液的制備

按處方比例及制法，制備缺三七總皂苷對(duì)照藥品。再按上述所得供試品溶液制備方法制成缺三七總皂苷的陰性對(duì)照溶液。

1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

1.4.1 色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參照《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版一部“三七總皂苷”指紋圖譜項(xiàng)，選用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱作為分析柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。

1.4.2 流動(dòng)相比例的選擇

照《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版一部“三七總皂苷”指紋圖譜項(xiàng)，選擇以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度分析。以分離度、峰的對(duì)稱性、保留時(shí)間等為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明以下表流動(dòng)相比例較好，見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相比例的選擇

1.4.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

見(jiàn)圖1-3，根據(jù)供試品的HPLC 圖譜，色譜柱的理論塔板數(shù)以人參皂苷Rg1峰計(jì)均不低于6 000。人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 的分離度均大于1.5。

圖1 對(duì)照品HPLC 圖譜

圖2 供試品HPLC 圖譜

圖3 陰性對(duì)照藥品HPLC 圖譜

2 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

取10 批不同生產(chǎn)批次的血塞通分散片，照2.2所得方法進(jìn)行處理，并按1.4 項(xiàng)的色譜條件，分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，記為S1-S11，其中S1對(duì)照品色譜，S2-S11分別為批號(hào)20150501、20150502、20150503、20150601、20150602、20150603、20150605、20150606、20150607、20150608 的血塞通分散片圖譜，見(jiàn)圖4。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1，對(duì)圖譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)及共有峰的共有圖譜信息擬合，得到血塞通分散片的HPLC 指紋圖譜，然后確定共有峰[9]。計(jì)算單峰面積占總峰面積的百分比，并以保留時(shí)間和峰面積較為平穩(wěn)的人參皂苷Rg1色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的值。

2.1 指紋圖譜

10 批血塞通分散片供試品生成共有峰32 個(gè)。其中，對(duì)照品與供試品生成共有峰29 個(gè)。選定其中5 個(gè)共有峰作為共有指紋峰，指紋峰的選擇原則是匹配度為100%，相對(duì)峰面積比值RSD≤10%，相對(duì)峰面積比值≥0.1[10]。經(jīng)單峰定位后，確定此5 個(gè)峰，按保留時(shí)間由小到大，依次分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd，為三七總皂苷中的主要有效成分，見(jiàn)圖5-6。

圖4 對(duì)照品及10 批供試品色譜圖

圖5 單峰定位結(jié)果

圖6 共有指紋峰圖譜

2.2 共有峰的峰號(hào)及保留時(shí)間

1 號(hào)峰，保留時(shí)間：19.774，為三七皂苷R1

2 號(hào)峰，保留時(shí)間：28.029，為人參皂苷Rg1

3 號(hào)峰，保留時(shí)間：29.335，為人參皂苷Re

4 號(hào)峰，保留時(shí)間：44.810，為人參皂苷Rb1

5 號(hào)峰，保留時(shí)間：49.503，為人參皂苷Rd以保留時(shí)間和峰面積較為平穩(wěn)的人參皂苷Rg1色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰峰面積的比值，見(jiàn)表3。

結(jié)果表明，5 個(gè)峰的相對(duì)峰面積比值RSD 小于5%，峰面積比值均在允許范圍（準(zhǔn)許誤差范圍是利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件所得）內(nèi)，5 個(gè)指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間一致性較好，指紋圖譜具有相似度較高的共有峰。

表3 共有指紋峰峰面積的比值

2.3 非共有峰

非共有峰面積占總峰面積10%～15%.

3 方法學(xué)考察

3.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各20μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1-3。在該色譜條件下的分離效果較好，對(duì)照品圖譜與供試品圖譜，相似度為0.98。陰性樣品在于對(duì)照品及供試品出峰相應(yīng)的保留時(shí)間處未見(jiàn)明顯色譜峰，表明本品中輔料成分對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 的測(cè)定無(wú)干擾。

3.2 精密度

取同一批次血塞通分散片，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25mg），精密稱定，照2.2 所得方法進(jìn)行處理，并按1.4 項(xiàng)的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20μL。記錄色譜圖，記為S1-S5。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件，對(duì)圖譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，計(jì)算相似度[11]。以人參皂苷Rg1色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.3 重復(fù)性

取重量差異項(xiàng)下本品，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25mg）6 份，照2.2 所得方法進(jìn)行處理，并按1.4 項(xiàng)的色譜條件，吸取供試品溶液各20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，記為S1-S6。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1，對(duì)圖譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，計(jì)算相似度。以保留時(shí)間和峰面積較為平穩(wěn)的人參皂苷Rg1色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表5。

3.4 穩(wěn)定性

取同一批次血塞通分散片，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25mg），精密稱定，照2.2 所得方法進(jìn)行處理，并按1.4 項(xiàng)的色譜條件，分別于0，2，4，8，12，16 h 精密吸取同濃度供試品溶液20μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，記為S1-S6。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版》軟件，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1，對(duì)圖譜信息進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，計(jì)算相似度。以保留時(shí)間和峰面積較為平穩(wěn)的人參皂苷Rg1色譜峰作為參比峰，計(jì)算各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 精密度考察

表5 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

表6 穩(wěn)定性考察

4 總結(jié)

本文以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd峰為參照峰，建立了血塞通分散片HPLC 指紋圖譜。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜超信息特征評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件對(duì)血塞通分散片HPLC 指紋圖譜定性、定量信息進(jìn)行多維的數(shù)據(jù)分析。采用雙定性相似度（SF 和SF’）和雙定量相似度（C 和P）來(lái)評(píng)價(jià)血塞通注射液指紋圖譜的化學(xué)成分分布比例特征和含量分布特征。評(píng)價(jià)出10 批血塞通注射液質(zhì)量完全合格。本實(shí)驗(yàn)所建立的血塞通注射液指紋圖譜具有良好的精密度和重現(xiàn)性，結(jié)合雙定性雙定量相似度評(píng)價(jià)法能較好地控制其質(zhì)量[12-15]。

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