消銀2 號對豚鼠銀屑病樣皮損組織病理學(xué)及PCNA 含量的影響*

劉海剛，李 欽，文曉燕，葉建州△

（1.云南中醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650011；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明650021）

銀屑病（Psoriasis）是一種常見的、易復(fù)發(fā)的慢性炎癥性紅斑鱗屑性皮膚病[1]。銀屑病受種族、地理、環(huán)境等因素的影響，各地的患病率從0 到11.8%不等[2-3]。我國銀屑病患病率約為0.47%，男女患病率接近[4]。根據(jù)銀屑病的臨床特征，通常可分為尋常型、膿皰型、關(guān)節(jié)型和紅皮病型，以尋常型最為多見，約占97.06%；其它類型占比較少[5]。消銀2 號為云南省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科葉建州主任醫(yī)師治療尋常型銀屑病血燥證之經(jīng)驗(yàn)方。本實(shí)驗(yàn)通過5%心得安法誘導(dǎo)銀屑病豚鼠模型，觀察消銀2 號對豚鼠銀屑病樣皮損組織學(xué)病理學(xué)評分（Baker 評分）、PCNA 含量的影響。探討其治療尋常型銀屑病的機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

普通級豚鼠，體質(zhì)量300～400g，雌雄各半，四川簡陽達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：Scxk（川）2008_24，合格證號：0002861。

1.2 藥物與試劑

“消銀2 號”流浸膏，當(dāng)歸飲子流浸膏，0.9%氯化鈉注射液（貴州天地藥業(yè)H52020069），鹽酸普萘洛爾原料藥（純度≥99%）（湖北興銀河化工有限公司20140211），PCNA ELISA 試劑盒（R&B 公司201406）。

1.3 主要儀器

Thermo 高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技），Thermo全自動酶標(biāo)儀洗板機(jī)（賽默飛世爾科技），石蠟切片機(jī)（Leica RM2235 型）、LEICA-DM2500 正置顯微鏡及圖文系統(tǒng)（德國徠卡）。

2 方法

2.1 分組及造模

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，第2 周開始實(shí)驗(yàn)，將豚鼠雙耳絨毛剃去，將豚鼠隨機(jī)分為6 組：空白組、模型組、對照組（當(dāng)歸飲子）和消銀2 號低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組8 只，參照文獻(xiàn)[6]除空白組豚鼠外，剩余5 組均用5%鹽酸普萘洛爾乳膏均勻涂抹豚鼠雙側(cè)耳背，面積約1cm2，厚度約1mm，4 次/d，共3 周。

2.2 給藥

造模3 周后開始給藥：消銀2 號高、中、低劑量組（26.7 g·kg-1、13.4 g·kg-1、6.68 g·kg-1）ig、當(dāng)歸飲子組（9.88 g·kg-1）ig、模型組和空白組生理鹽水ig，每日1 次，共2 周。每2d 測量1 次體質(zhì)量，調(diào)整給藥量。

2.3 檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 豚鼠耳部銀屑病樣皮損組織病理學(xué)評分

用藥2 周后，10%水合氯醛麻醉，頸動脈采血后處死，隨即剪取雙側(cè)耳組織。耳組織分3 份，其中1份液氮冷凍后-80℃冰箱保存（待組織勻漿用），其余2 份常規(guī)修剪制片，最后在光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。參照Baker 法[7]制定病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。Baker 法積分評估的標(biāo)準(zhǔn)如下：角質(zhì)層中見有Munro小膿瘍計2.0 分；角化過度計0.5 分；角化不全計1.0 分；表皮層中見有顆粒層變薄或消失計1.0 分；棘層肥厚計1.0 分；皮突延長、基底層迂曲起伏，根據(jù)輕、中、重程度分別計0.5 分、1.0 分、1.5 分；真皮層見有單一核及多形核細(xì)胞浸潤，根據(jù)輕、中、重程度分別計0.5 分、1.0 分、2.0 分；乳頭突出明顯計0.5分；真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張計0.5 分。

2.3.2 豚鼠銀屑病樣皮損PCNA 含量測定

采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），按照試劑盒操作說明操作，經(jīng)酶標(biāo)儀分析得出各組豚鼠耳部皮損中PCNA 含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行計算，各組計量資料均使用（x±s）表示。符合正態(tài)分布、方差齊用方差分析，方差不齊采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 造模過程中豚鼠耳部皮損變化

見圖1-3。

圖1 造模前

圖2 造模1 周

圖3 造模結(jié)束

3.2 病理片

皮損組織病理片顯示：模型組豚鼠耳組織出現(xiàn)角化不全或角化過度、Muro 微膿瘍、顆粒層變薄或消失、炎細(xì)胞浸潤，真皮淺層血管擴(kuò)張，真皮乳頭突出，提示造模成功（見圖5）。

圖4 空白組10×20 倍

圖5 模型組10×20 倍

3.3 組織病理學(xué)Baker 評分

見表1-表2。

表1 空白對照組與模型組Baker 評分值的比較（x±s）

表2 豚鼠銀屑病病理Baker 分值（x±s）

3.4 豚鼠耳部皮損部位PCNA 含量

見表3。

表3 各組豚鼠皮損部位PCNA 含量測定

4 討論

銀屑病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為與多基因遺傳因素、多環(huán)境因素、免疫及炎癥刺激有關(guān)，其中細(xì)胞及體液免疫功能異常均參與了銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[8]。尋常型銀屑病根據(jù)臨床表現(xiàn)，多分為三型[9]，血熱內(nèi)蘊(yùn)證、血虛風(fēng)燥證、瘀滯肌膚證。銀屑病皮損主要表現(xiàn)為角化不全、細(xì)胞更替時間縮短、乳頭上方表皮變薄、血管擴(kuò)張和炎性浸潤。本次實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)豚鼠銀屑病模型，結(jié)果顯示消銀2 號各組均能明顯改善皮損組織病理學(xué)評分。目前在銀屑病的治療方面，西醫(yī)傳統(tǒng)采用抗腫瘤藥物、維A 酸類、角質(zhì)促成劑、復(fù)方甘草酸苷、維生素D3衍生物等藥物及物理療法[10-15]；近年來生物制劑也開始逐步運(yùn)用于銀屑病的治療[16]，但高昂的費(fèi)用限制了其廣泛推廣使用。銀屑病嚴(yán)重影響患者質(zhì)量，目前的治療措施雖然有效，但不能達(dá)到長期的緩解[17]，中醫(yī)中藥在治療銀屑病方面療效好、副作用少，長期以來被患者廣為接受。

消銀2 號為葉建州主任醫(yī)師結(jié)合云南本地特色中藥，在云南省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科經(jīng)過多年的臨床運(yùn)用總結(jié)而成。本方由生地黃、熟地黃、丹參、露蜂房、金銀花、重樓、白鮮皮、玄參、麥冬、當(dāng)歸、天花粉、烏梢蛇、昆明山海棠組成。臨床診治辨證為血燥證銀屑病患者時臨癥加減，可改善皮損鱗屑增多、干燥等癥狀，延緩復(fù)發(fā)。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)，有文獻(xiàn)報道其在銀屑病發(fā)病中占重要地位，Kawahira[18]研究發(fā)現(xiàn)PCNA 在銀屑病皮損中高度表達(dá)，而經(jīng)治療皮損消退后其表達(dá)降低，這與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。但本次實(shí)驗(yàn)陽性對照藥當(dāng)歸飲子在降低PCNA 含量方面，與模型組比較（P=0.062），無統(tǒng)計學(xué)意義，分析可能與用藥時間短、取材及操作誤差有關(guān)。該方在改善豚鼠銀屑病皮損組織病理學(xué)Baker 評分方面，與公認(rèn)的尋常型銀屑病血燥證方藥當(dāng)歸飲子比較，效果相當(dāng)（P＞0.05）；在降低皮損PCNA 含量方面，消銀2 號優(yōu)于當(dāng)歸飲子，可降低PCNA 含量，抑制其表達(dá)，改善銀屑病的發(fā)病。綜合分析，本實(shí)驗(yàn)為尋常型銀屑病血燥證的中醫(yī)辨證組方用藥提供了新的思路，同時為消銀2 號治療尋常型銀屑病血燥證提供理論基礎(chǔ)。

[1] 黃英舉，鄭小帆，劉卉，等. 銀屑病治療研究新進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（4）：180-181.

[2] Raychaudhuri SP，F(xiàn)arber EM. The prevalence of psoriasis in the world [J]J Eur Acad Dermatol Venereol，2001，15（1）：16-17.

[3] Chandran V，Raychaudhuri SP. Geoe pidemiology and environmental factors of psoriasis and psoriatic arthritis [J]. J Autoimmun，2010，34（3）：J314-321.

[4] 丁曉嵐，王婷林，沈佚葳，等. 中國六省市銀屑病流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志，2010，24（7）：598-601.

[5] 趙辯. 臨床皮膚病學(xué)[M]. 3 版. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2001：759-766.

[6] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1203.

[7] Baker BS，Brent L，Valdimarsson H，et al. Is epidermal cell proliferation in psoriatic skin grafts on nude mice driven by T-cell derived cytokines？[J]. Br J Dermatol，1992，126（2）：105-110.

[8] 黃桂新. 銀屑病病因與發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥指南，2012，10（13）：73-74.

[9] 中華中醫(yī)藥學(xué)會. 中醫(yī)皮膚科常見病診療指南[S]. 北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：T342.

[10] 李雙鳳. 甲氨蝶呤治療中重度尋常型銀屑病的臨床療效觀察[J]. 皮膚性病診療學(xué)雜志，2012，19（4）：228-229.

[11] 張付菊，梁亮. 維胺脂膠囊聯(lián)合消銀湯治療尋常型銀屑病52 例[J]. 天津藥學(xué)，2008，20（2）：39-40.

[12] 張貫高，趙麗. 中西醫(yī)結(jié)合治療銀屑病38 例療效觀察[J]. 河南中醫(yī)，2005，25（12）：78.

[13] 姚舒，都日亮，徐世新. 復(fù)方甘草酸苷片聯(lián)合復(fù)方氟米松治療尋常型銀屑病臨床觀察[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（34）：152-153.

[14] 曹萍，王曉川，吳穎. 阿維A 治療尋常性銀屑病的臨床療效觀察[J]. 中國皮膚性病學(xué)雜志，2008，22（1）：61-62.

[15] 王月梅. 復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合卡泊三醇治療尋常型銀屑病的臨床觀察[J]. 中國實(shí)用醫(yī)藥，2011，6（30）：143-144.

[16] 張學(xué)軍. 皮膚性病學(xué)[M]. 8 版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：139.

[17] 馬曉蕾，周城，蔡林，等. 生物制劑治療銀屑病的研究進(jìn)展[J]. 臨床皮膚科雜志，2012，41（9）：577-579.

[18] Kawahira K.Immunohistochemical staining of proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in malignant and nonmalignant skin disease[J]. Arch Dermatol Res，1999，291（7-8）：413-418.