健脾方對皮膚屏障功能障礙模型小鼠影響的實驗研究*

孫曉菲，楊皓然，方 凱，解宇環

（云南中醫學院，云南 昆明650500）

人體皮膚是直接與外界接觸的器官，為人體免疫系統的第一道屏障。皮膚屏障異常是導致皮膚疾病的重要因素，特應性皮炎、銀屑病、接觸性皮炎等多種皮膚病的發生都與皮膚屏障功能的異常有關[1]。中醫藥治療上述疾病在緩解病情、防止復發、提高患者的生存質量等方面具有一定優勢。明申斗垣在《外科啟玄》中說過：“言瘡雖生于肌膚之外，而其根本原集予臟腑之內”[2]，現代醫家也多認為皮膚疾病往往由內外因合而發病，因而辨治也應將局部皮膚辨證與整體臟腑辨證有機地結合起來內外兼治，才能真正獲得滿意療效[3-5]。健脾法是中醫治療皮膚屏障障礙性疾病的重要治法，但對于該治法的研究，現多局限于方藥對患者機體免疫調節的影響而較少關注對皮膚機械屏障的作用。因而本文選用健脾方中的代表方參苓白術散和六君子湯為研究對象，觀察兩方對小鼠皮膚屏障障礙模型的影響，揭示健脾法治療上述皮膚屏障功能障礙疾病的機制，并通過比較兩方對皮膚屏障的作用的差異，初步探討健脾滲濕法和益氣健脾法對皮膚屏障功能影響的異同。

1 材料

1.1 動物

SPF 級ICR 小鼠，雌雄各半，體質量18～22g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。合格證號：SCXK（京）2014-0004。

1.2 藥品與試劑

參苓白術散：人參60g，茯苓60g，炒白術60g，山藥60g，炒白扁豆45g，蓮子肉30g，炒薏苡仁30g，砂仁30g，炒桔梗30g，炙甘草60g；六君子湯：人參36g，茯苓36g，炒白術36g，炙甘草24g，陳皮12g，半夏18g，所有藥材均購自昆明市“一心堂”連鎖藥店，經中藥鑒定教研室張潔老師鑒定為正品。按方中比例水煎、過濾、濃縮制成浸膏，4℃保存。神經酰胺標準品（美國sigma aldrich 公司），胰酶（Lot no：MR28175，法國）；其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器

YLS-Q4 耳腫打耳器，購自山東省醫學科學院設備站；HX086146 薄層色譜硅膠板，購自德國Merck 公司；Vapo Meter 測量儀，購自芬蘭Delfin Technologies 公司，ECLIPSE 50i 生物顯微鏡，購自日本Nikon 公司。

2 方法

2.1 動物分組及處理

將健康ICR 小鼠，根據體質量分層隨機分為8組。即正常對照組、模型組、參苓白術散和六君子湯組。除參苓白術散和六君子湯各組分別灌胃給予不同濃度的水煎液外，其余各組灌胃給予等體積蒸餾水，每天1 次，連續13d。除正常對照組外，其余各組從給藥第9 天起，以膠帶法復制皮膚機械屏障障礙模型，剃去小鼠頸背部被毛后，用強力膠帶粘貼該處皮膚4～5 次，每日2 次，中間間隔8h，連續5d。造模第5 天，檢測完TEWL 值后將小鼠處死，取下造模處皮膚，用打耳器將取下的皮膚打成圓片供表皮厚度測量和神經酰胺檢測。

2.2 表皮經皮水分丟失量（TEWL）測定

用Vapo Meter 測量儀測定小鼠頸背部皮膚TEWL，室溫20～25℃，空氣相對濕度50%～60%. 測量儀器與測量部位皮膚表面垂直接觸，每一測試部位測量3 次，讀出數值并記錄，取其平均值。

2.3 表皮厚度測量

10%中性甲醛中固定小鼠表皮48h 后，脫水、包埋、HE 染色。于40 倍鏡下從視野觀察到的皮膚最上端開始拍第一張圖片，之后顯微鏡標尺每移動2mm 拍一張圖片，每張圖片取5 圖，圖片拍完后用Image-Pro plus 6.0 形態學分析軟件在每張圖片上任選5 個點，一張皮膚共選25 個點測量小鼠的表皮厚度，再將25 點的厚度值取平均值即為每只小鼠表皮厚度值。

2.4 表皮神經酰胺含量的測定

參照參考文獻[6]報道方法。

2.4.1 表皮脂質的提取

用打耳器打成面積約為50mm2大小的皮膚圓片共6 片。將所取皮片浸泡于胰酶中，37℃水浴1h，4℃冰箱放置過夜后取出，分離表皮，以Bligh＆Dyer法[7]抽提表皮脂質，氮氣吹干，-80℃冰箱保存。

2.4.2 對照品的制備和標準曲線繪制

稱取神經酰胺對照品5.0mg，加氯仿定容，得0.2mg·mL-1對照品溶液。精密吸取2，4，6，8，10，12，14μL 神經酰胺對照品溶液點于薄層板上展開，晾干后再于氯仿∶甲醇∶氨水=90∶10∶0.5 中展開；噴灑顯色劑于140℃下烘干顯色。顯色后采集圖片并用Image J 軟件分析，測定灰度值。經計算得到回歸方程：y=5346.3x+4222.2，R2=0.9973，線性關系良好，線性范圍為0.4～2.8μg。

2.4.3 小鼠皮膚神經酰胺含量測定

吸取對照品溶液、供試品溶液，按上述條件測定灰度值，最終換算出神經酰胺含量。

2.5 統計方法

實驗數據用（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊，組間兩兩比較采用LSD 法；方差不齊的采用秩和檢驗。取P＜0.05 為具有統計學意義。

3 結果

3.1 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠皮膚TEWL 的影響

與正常對照組比較，皮膚屏障障礙模型小鼠TEWL 增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，參苓白術散和六君子湯組均能能減少TEWL（P＜0.01），其中參苓白術散組較六君子湯組TEWL 明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠皮膚TEWL值的影響

3.2 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度的影響

與正常對照組比較，皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，參苓白術散組和六君子湯組能降低小鼠表皮厚度（P＜0.05），而兩給藥組之間差異無統計學意義。見表2。

表2 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠表皮厚度的影響

3.3 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠皮膚神經酰胺含量的影響

與正常對照組比較，皮膚屏障障礙小鼠神經酰胺含量降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，參苓白術散組和六君子湯組能升高小鼠皮膚中神經酰胺含量（P＜0.01，P＜0.05），而兩給藥組之間差異無統計學意義。見表3。

表3 健脾方對皮膚屏障障礙小鼠皮膚神經含量的影響

4 討論

皮膚屏障有廣義和狹義之分，廣義的皮膚屏障主要涉及與皮膚各層結構相關的屏障；狹義的皮膚屏障主要包括皮膚角質層（SC）結構相關的屏障[8]。皮膚屏障功能通常指表皮尤其是角質層的物理性或機械性屏障結構，主要結構基礎是表面角質形成細胞形成的角質層、角質細胞間的脂類、天然保護因子（Natural moisturizing factor，NMF）等[9]。角質形成細胞間隔地“堆砌”于連續的富含特定脂類的細胞間基質中而形成了經典的“磚-墻”結構體系[10]。角質層細胞間脂質由大約50%神經酰胺、25%膽固醇、15%游離脂肪酸和一些次要的脂質組成[11]。神經酰胺在調節皮膚的生物活性及表皮的生理功能中起重要作用，其減少可引起皮膚屏障功能異常和修復的延遲[12-13]。阻止水分經皮擴散和電解質流失，這是皮膚角質層最重要的屏障功能之一[14]。TEWL 并不直接表示角質層的水分含量，而是表明水分經角質層散失的情況，TEWL 值越高，表明經皮膚散失的水分越多，角質層的屏障功能越差[15]。實驗表明，小鼠表皮經過膠帶反復粘貼后，TEWL 值升高，小鼠皮膚屏障功能下降。形態學觀察發現皮膚角質層剝脫或過度增生、細胞層次增多，進一步研究發現表皮中神經酰胺含量降低，說明該模型是通過破壞皮膚角質層的結構、減少脂質含量而造成皮膚屏障的功能障礙。

中醫理論認為，脾主濕而惡濕，凡稟賦素弱、勞倦過度、飲食失宜，均能使脾失健運、水濕內停、釀成內濕、浸淫肌膚、走竄四肢而外發皮膚病。治以健脾助運、兼理濕邪。健運中土，則脾氣轉強，水谷得化；內濕消除，則輸津于膚，外燥自解[16]。給予健脾方參苓白術散和六君子湯后，二者均能降低模型小鼠的TEWL 值，減少表皮厚度，提高表皮神經酰胺的含量，說明即便沒有脾虛見證，健脾方藥對皮膚屏障功能障礙也有修復作用。參苓白術散是臨床上常用的健脾滲濕代表方藥，具有益氣健脾，滲濕止瀉之功效。本研究發現參苓白術散對皮膚功能障礙的改善作用優于六君子湯，尤以降低TEWL 值為明顯，而對神經酰胺含量的影響二者差異也表現出一定趨勢。這也初步證實了中醫臨床常以健脾與利濕治法相結合治療皮膚疾病的科學合理性。

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