高效液相色譜法測定感冒熱毒清合劑中連翹苷的含量

鄒曉華等

[摘要] 目的 建立感冒熱毒清合劑中連翹苷的高效液相色譜（HPLC）法含量測定方法。 方法 對處方中連翹進行定性鑒別，并對連翹苷進行HPLC法測定，采用色譜柱資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相乙腈-水（76∶24），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長277 nm。 結(jié)果 連翹苷在6.88～137.6 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9992），連翹苷的平均回收率為99.20%、99.96%、98.73%。 結(jié)論 本文首次建立了感冒熱毒清合劑中連翹苷的HPLC含量測定方法，結(jié)果準確，重復性好，可作為感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評價方法。

[關(guān)鍵詞] 感冒熱毒清合劑；連翹苷；高效液相色譜法；含量測定

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0117-04

[Abstract] Objective To establish a method on content determination of phillyrin in Ganmao-reduqing Mixture by high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods Phillyrin was performed qualitative identification. The content of phillyrin in mixture was determined by HPLC with a SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）， acetonitrile-water （76∶24） was used as mobile phase and the flow rate was 1.0 mL/min. The columm temperature was set at 30℃ and the wavelength of the detector was set at 277 nm. Results The linear range for phillyrin was 6.88-137.6 μg/mL and the correlation cofficient was 0.9992. The average recovery of phillyrin was 99.20%， 99.96%， 98.73% respectively. Conclusion This is the first time to establish a method using HPLC for determination of phillyrin in Ganmao-reduqing Mixture. The method is accurate， reproducible and suitable to be used for quality assessment of Ganmao-reduqing Mixture.

[Key words] Ganmao-reduqing Mixture； Phillyrin； High performance liquid chromatography； Content determination

感冒熱毒清合劑（南制字2011F19001）是解放軍第一一七醫(yī)院結(jié)合長年的臨床實踐，并進行處方篩選而研制成的適合臨床、治療感冒效果好、質(zhì)量穩(wěn)定的純中藥制劑。該合劑由連翹、板藍根、金銀花等組成，連翹具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風熱；用于癰疽，瘰疬，乳癰，丹毒，風熱感冒，溫病初期，溫熱入營，高熱煩渴，神昏發(fā)斑，熱淋澀痛[1-2]。連翹苷為連翹中主要成分之一，現(xiàn)代藥理學和臨床研究表明連翹中的連翹苷具有抗菌、抗病毒、強心、抑制毛細血管通透性、抗肝損傷等作用[3]。感冒熱毒清合劑質(zhì)量標準中有性狀、鑒別、檢查等檢驗項目，但沒有建立組方中主要成分的含量測定方法，隨著中藥制劑的發(fā)展，對中藥制劑的質(zhì)量提出了更高要求[4-7]。本文選取連翹苷為指標成分，連翹苷為連翹中的主要成分，建立高效液相色譜法含量測定方法[2，8-16]，該方法穩(wěn)定性及重復性較好，測定結(jié)果準確可靠，可作為醫(yī)院制劑-感冒熱毒清合劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀LC-20A型（日本島津）、電子天平AE240（瑞士Mettler）、HH-S數(shù)控恒水浴鍋（金華市文華科教實驗儀器廠）、KQ-400DB型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

感冒熱毒清合劑供試品（解放軍第一一七醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，批號：20140218、20131220、20140401、20140117、 20131024），連翹苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201213）、正丁醇為分析純（天津市永化化學試劑有限公司，批號：20120507），氨水為分析純（浙江三鷹化學試劑有限公司，批號：20130901）。甲醇、乙腈均為色譜純（德國Merck公司，批號：20140114）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

取感冒熱毒清合劑20 mL，加水飽和的正丁醇提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液，加氨試液20 mL和水20 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層水浴蒸干，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取連翹苷對照品，加乙醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-冰醋酸（8.5∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘至斑點清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.2 定量測定

2.2.1 色譜條件 連翹苷的色譜條件：色譜柱為資生堂SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈-水（76∶24），檢測波長277 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，理論板數(shù)按連翹苷峰計算，應不低于3000。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取連翹苷對照品3.44 mg，加入25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為連翹苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取感冒熱毒清合劑樣品50 mL，加水飽和的正丁醇50 mL萃取2次，合并2次的正丁醇層溶液，加氨試液50 mL洗滌，棄去水層，正丁醇層置80℃水浴蒸干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容至刻度，作為連翹苷含量測定的供試品溶液。按處方比例及工藝制備不含連翹的陰性對照溶液適量，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.4 專屬性考察 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，測定，結(jié)果陰性對照品溶液在連翹苷峰相應的保留時間附近無干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見圖1。

2.2.5 標準曲線 精密量取連翹苷對照品溶液，進行梯度稀釋，注入液相色譜儀各10 μL，記錄連翹苷峰面積。以連翹苷濃度（X）為橫坐標，連翹苷峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：Y = 14787X-60772，r = 0.9992，結(jié)果表明，連翹苷對照品濃度在6.88～137.6 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取連翹苷對照品溶液10 μL，重復進樣5次，測定峰面積。結(jié)果平均峰面積的RSD = 1.80%，表明儀器精密度良好。精密吸取連翹苷對照品溶液10 μL，重復進樣5次，測定峰面積。結(jié)果平均峰面積的RSD = 0.99%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取批號為20140218的感冒熱毒清合劑，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于常溫條件放置0、4、8、12、24 h后，分別進樣20 μL，記錄連翹苷的峰面積。結(jié)果RSD = 1.31%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重現(xiàn)性試驗 按照“2.2.3”供試品溶液制備方法，將同一批次，批號為20131220樣品平行制備5份供試品溶液，分別測定連翹苷的含量。結(jié)果RSD = 1.24%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的感冒熱毒清合劑適量，共9份，每份10 mL分別精密加入高、中、低濃度的連翹苷對照品，按“2.2.3”項下方法操作，測定并計算連翹苷加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.10 樣品含量測定 取感冒熱毒清合劑5批樣品（批號：20140218、20131220、20140401、20140117、20131024），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀中進行連翹苷含量測定，結(jié)果見表2。

3 討論

連翹為本合劑處方中的主要成分，連翹有效成分連翹苷具有極強的抗菌、抗病毒活性，其對金黃色葡萄球菌的抑制作用比四環(huán)素強，是迄今為止連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強的成分之一，為中藥連翹的主要特征性成分。連翹酚對金黃色葡萄球菌、志賀菌也有一定的抑菌作用。連翹還可直接破壞內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)，以消除或減輕細菌毒素引起的休克等各種中毒癥狀[2]。對連翹進行定性及含量測定極其重要。

以薄層色譜法對連翹進行定性鑒別實驗，把連翹中的有效成分連翹苷作為對照品，陰性樣品同時作比較。經(jīng)文中的展開劑和乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）為展開劑展開，供試品色譜均在連翹苷相應位置顯相同顏色的斑點；而陰性樣品色譜在連翹苷相應位置不顯此斑點，證明其他成分無干擾，具有鑒別專屬性。含量測定方法結(jié)合《中國藥典》中連翹的含量測定方法和文獻報道[8-10]，本實驗采用高效液相色譜法測定連翹中連翹苷的含量，檢測波長選擇277 nm，理論板數(shù)按連翹苷峰計算應不低于3000。感冒熱毒清合劑成分復雜，在供連翹苷含量測定用的供試品溶液制備過程中，采用正丁醇萃取，氨水洗滌并濃縮的方法，該方法可去除合劑中其他成分對連翹苷在高效液相色譜圖上的干擾。

本研究對感冒熱毒清合劑中的連翹苷進行定性鑒別及含量測定，建立了連翹指標成分的含量測定方法，該方法結(jié)果準確，重復性好，可作為醫(yī)院制劑-感冒熱毒清合劑的質(zhì)量評價方法。

本實驗發(fā)現(xiàn)不同批號樣品中連翹苷含量有差別，這是由于藥材具有較廣的分布區(qū)，不同地區(qū)居群往往具有不同的基因型，其原因除與各個地方的生態(tài)環(huán)境等自然因素有關(guān)外，還有可能受栽培技術(shù)、采收時間、產(chǎn)地加工等因素影響。研究表明，不同產(chǎn)地連翹中有效成分的含量差異較大，原材料產(chǎn)地、采集時節(jié)不同，存放時間及條件不同，對合劑中的連翹苷含量有較大影響[17-20]。因此，該合劑的質(zhì)量控制應嚴格從源頭抓起，即嚴格把握原藥材的質(zhì)量。

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（收稿日期：2015-02-19 本文編輯：李亞聰）