程序性細胞死亡因子4與細胞色素C在上皮性卵巢癌中的表達及其關系

李霞　裴艷麗

[摘要] 目的 研究上皮性卵巢癌組織中程序性細胞死亡因子4（PDCD4）和細胞色素C（Cyt C）的表達及其關系，探討PDCD4誘導細胞凋亡的途徑。 方法 收集2010年1月～2015年1月菏澤市立醫院婦科62例手術切除的卵巢癌標本，采用免疫組織化學法檢測上皮性卵巢癌石蠟標本中PDCD4和Cyt C表達情況，采用配對χ2檢驗分析PDCD4與Cyt C表達的關系。 結果 62例患者中33例（53.2%）患者PDCD4呈陰性表達，29例（46.8%）患者PDCD4呈陽性表達；40例（64.5%）患者Cyt C呈陰性表達，22例（35.5%）Cyt C呈陽性細胞表達。PDCD4蛋白表達呈陽性的患者Cyt C表達亦多呈陽性；Cyt C蛋白表達呈陰性的患者PDCD4表達亦多呈陰性，配對χ2檢驗結果顯示，PDCD4和Cyt C的表達具有一定的相關性（χ2=5.652，P < 0.05）。 結論 上皮性卵巢癌中PDCD4和Cyt C表達密切相關，PDCD4可能通過線粒體途徑引起Cyt C釋放，啟動凋亡程序，誘導細胞凋亡。

[關鍵詞] 上皮性卵巢癌；程序性細胞死亡因4；細胞色素C

[中圖分類號] R737.31 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0107-03

[Abstract] Objective To research expression of programmed cell programmed cell death 4 （PDCD4） and Cytc in epithelial ovarian cancer in epithelial ovarian cancer and its relationship， to investigate the pathways of PDCD4 induce apoptosis of pancreatic cancer cells. Methods 62 patients who received pancreatic resection from January 2010 to January 2015 in Heze Municiple Hospital were collected. The expression of Cyt C and PDCD4 in the samples was detected by immunohistochemistry， and the relationship between PDCD4 and Cyt C in pancreatic cancer was analyzed by applying paired χ2 test. Results Compared with the regular pancreatic tissues， the expression of Cyt C and PDCD4 in the cancer cells were significantly decreased. Among 62 samples， 37 cases （59.7%） had negative expression of PDCD4， 25 cases （40.3%） had positive expression of PDCD4； 45 cases （72.6%） had negative expression of Cyt C， 17 cases （27.4%） had positive expression of Cyt C. In general， patients who had positive expression of PDCD4 would have negative expression of Cyt C， and the patients who had negative expression of Cyt C would have negative expression of PDCD 4 as well. Paired χ2 test showed that， the expression of those two components were closely correlated （χ2=5.652， P < 0.05）. Conclusion There is a close relationship between expression of PDCD 4 and Cyt C in pancreatic cancer. PDCD 4 may induce the apoptosis of pancreatic cancer cells through mitochondria.

[Key words] Epithelial ovarian cancer； Programmed cell death 4； Cytochrome C

卵巢癌的發病率居婦科惡性腫瘤的第三位，病死率居首位[1]。卵巢癌的特點主要是起病隱匿，早期缺乏典型癥狀和成熟的早期診斷方法，超過70%的患者確診時已屬晚期，約70%的患者在兩年內復發[2]，嚴重威脅廣大婦女的生命。腫瘤的發生、發展需要細胞增殖能力增強和凋亡能力下降 。細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）從線粒體釋放到細胞質是凋亡程序關鍵的一步，在凋亡機制中發揮著重大作用，是細胞凋亡過程中關鍵的細胞器之一，線粒體功能障礙導致Cyt C從線粒體膜間隙釋放是多種細胞凋亡的普遍現象[3]。程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是新近發現的腫瘤抑制基因。通過抑制腫瘤細胞蛋白轉錄和翻譯過程抑制腫瘤增殖。最近有文獻報道，肺癌組織中的PDCD4表達明顯下降或缺失，并與肺癌的惡性程度及不良預后有關[4]。本研究通過分析卵巢癌組織中PDCD4與Cyt C表達，探討PDCD4誘導卵巢癌細胞凋亡的途徑。由此為卵巢癌的新的基因治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2010年1月～2015年1月年菏澤市立醫院婦科62例手術切除的卵巢癌標本，所有標本均經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4 μm厚連續切片以備免疫組織化學和病理分析使用。62例患者中，年齡35～69歲，分化程度：高分化腺癌21例，中分化腺癌16例，低分化腺癌25 例。根據國際婦產科學聯盟2000年的手術-病理分期，Ⅰ期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ期22例，Ⅳ期5例。所有患者術前均未接受放療和化療。

1.2 主要試劑

兔抗人PDCD4 抗體購于上海安妍責任有限公司及兔抗人Cyt C抗體購于上海萬疆生物技術有限公司。PV-6001試劑盒購于北京欣興唐生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化染色 采用免疫組化非生物素二步法。染色步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3.2 免疫組化結果判斷 由兩名病理科醫生雙盲下在顯微鏡下觀察每張組織切片的顯色反應，以胞漿或胞核出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。每張切片計數10個視野，每個視野各計數100個細胞，取陽性細胞數百分比的平均值。PDCD4 陽性信號定位于胞漿或胞核，細胞不顯色或陽性細胞<30%為陰性，陽性細胞≥30%為陽性。Cyt C的表達陽性細胞數≥10%為陽性，陽性細胞數<10%為陰性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，采用配對χ2檢驗分析PDCD4與Cyt C表達的關系，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDCD4蛋白在卵巢癌組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，62例卵巢癌患者中33例為PDCD4陰性表達，占53.2%。29例為PDCD4陽性表達，占46.8%。見圖1（封三）。

2.2 細胞色素C蛋白在卵巢癌組織中的表達

免疫組織化學染色結果顯示，62例卵巢癌患者中40例為Cyt C陰性表達，占64.5%。22例為Cyt C陽性表達，占35.5%。見圖2（封三）。

2.3 PDCD4蛋白表達和Cyt C蛋白表達的關系

在29例PDCD4蛋白呈陽性表達的患者中17例Cyt C也呈陽性表達，占58.6%（17/29），在40例Cyt C蛋白呈陰性表達的患者中28例PDCD4也呈陰性表達，占70.0%（28/40），配對χ2檢驗結果顯示，PDCD4和Cyt C的表達具有一定的相關性（χ2=5.652，P < 0.05）。

3 討論

卵巢癌在婦科腫瘤中發病率僅次于宮頸癌和子宮體癌居第三位，而其致死率卻占首位[5]。Goff等[6]從美國48個州和加拿大4個省共收到1725份反饋的流行病學調查表，調查結果顯示，95%卵巢癌婦女在確診前就已報告癥狀的存在，因此，研究卵巢癌的關鍵在于早期發現、早期診斷和早期治療。卵巢癌的早期診斷技術包括卵巢癌蛋白質組學技術、免疫學和基因檢測技術等。因此，新的抑癌基因的出現將會為卵巢癌的診治提供新的途徑。

PDCD4基因于1995年被克隆成功，定位于染色體10q24編碼的185個氨基酸。PDCD4蛋白具有多個磷酸化位點，可與蛋白激酶C、脯氨酸激酶、酪氨酸激酶相結合。Vikhreva等[7]研究發現PDCD4在肺癌中的表達是減弱或缺失的。Gianmaria[2]同時也證實了PDCD4是腫瘤抑制因子，在腫瘤形成的過程中受到AKt信號轉導通路調控。本研究采用免疫組織化學方法檢測了62例卵巢癌石蠟標本中的PDCD4的表達情況，結果顯示，62例卵巢癌患者中33例為PDCD4陰性表達，占到病例總數的53.2%，29例為PDCD4陽性表達，占到病例總數的46.8%。上述研究結果提示，PDCD4表達升高可能參與腫瘤生長的抑制，是一種新的腫瘤抑制基因，在卵巢癌的發生發展中起著一定作用。有研究表明，在胃癌、大腸癌、食管癌中可檢測到PDCD4表達下調甚至缺失，并且PDCD4表達的下調甚至缺失與腫瘤的進展和患者的預后密切相關[8-10]

有研究表明，細胞色素C 從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，凋亡發生時Cyt C從線粒體中釋放出來。腫瘤的發生、發展需要細胞增殖能力增強和凋亡能力下降[11]。本研究還采用免疫組織化學方法檢測了62例卵巢癌石蠟標本中的Cyt C的表達情況，結果顯示，62例卵巢癌患者中40例為Cyt C陰性表達，占到病例總數的64.5%，22例為Cyt C陽性表達，占到病例總數的35.5%。在卵巢癌的成瘤過程中細胞調亡減低導致癌癥細胞無限制地增長，打破了正常組織的代謝規律，這也是已經被證實的理論。最初PDCD4是人們在研究調亡細胞時發現的，認為它是一種凋亡相關基因，不僅影響了細胞程序性死亡而且通過抑制蛋白翻譯的起始抑制腫瘤的發生、發展。在細胞發生凋亡時，PDCD4表達增加。Wang等[12]研究表明，PDCD4通過下調FLIP的表達來影響胃癌細胞對紫杉醇注射液所引發的調亡敏感性。最近Kevin等[13]研究發現，人們肺血管內皮細胞的凋亡受到PDCD4的控制。

在本次研究中證明了PDCD4和Cyt C低表達或表達缺失對于上皮性卵巢癌的形成起到了一定的作用。25例PDCD4蛋白呈陽性表達的患者中14例Cyt C也呈陽性表達，占56%（14/25），在45例Cyt C蛋白呈陰性表達的患者中28例PDCD4也呈陰性表達，占62.2%（28/45），配對χ2檢驗結果提示，PDCD4和Cyt C對于上皮性卵巢癌形成是有相關性的。提示了PDCD4可能通過線粒體途徑導致細胞凋亡，這個過程中有Cyt C的釋放。而對于上皮性卵巢癌的發生發展可能是PDCD4表達的下降引起Cyt C的釋放，進而誘發腫瘤凋亡過程受到抑制。

[參考文獻]

[1] Siegel R，Naishadham D，Jemal A. Cancer statistics，2012 [J]. CA Cancer J Clin，2012，62（1）：10-29.

[2] Gianmaria P，Francesca G. The PDCD4/miR-21 pathway in medullary thyroid carcinoma [J]. Human Pathology，2014， 46（1）：50-57.

[3] Lankat-Buttgereit B，Goke R. Programmed cell death protein 4（pdcd4）：a novel target for antineoplastic therapy？ [J]. Biol Cell，2003，95（8）：515-519.

[4] Lankat-Buttgereit B，Goke R. The tumour suppressor Pdcd4：recent advances in the clucidation of function and regulation [J]. Biol Cell，2009，101：309-317.

[5] Siegel R，Naishadham D，Jemal A. Cancer statistics，2012 [J]. CA Cancer J Clin，2012，62（1）： 10-29.

[6] Goff BA，Mandel LS，Melancon CH，et al. Frequency of symptoms of ovarian cancer in women presenting to prim ary care clinics [J]. JAMA，2004，291（22）：2705-2712.

[7] Vikhreva PN，Shepelev MV，Korobko IV，et al. mTOR-dependent transcriptional repression of PDCD4 tumor suppressor in lung cancer cells [J]. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms，2014，1839（1）：43-49.

[8] Motoyama K，Inoue H，Mimori K，et al. Clinicopathological and prognosticsignificance of PDCD4 and micro RNA-21 in human gastric Cancer [J]. Int J Oncol，2010，36（5）：1089-1095.

[9] Mudduluru G，Medved F，Grobholz R，et al. Loss of programmed celldeath 4 expression marks adenoma -carcinoma transition，correlates inversely with phosphorylated protein kinase B， and is an independent，prognostic factor in resected colorectal cancer [J]. Cancer，2007，110（8）：1697-1707.

[10] Fassan M，Caqol M，Pennelli G，et al. Programmed cell death 4 protein in esophageal cancer [J]. Oncol Rep，2010，24（1）：135-139.

[11] Yoshida H. Apaf-1 is required for mitochondrial pathways of apoptosisand brain development [J]. Cell，1998， 94（6）：739-750.

[12] Wang WQ，Zhao JJ，Wang HB，et al. Programmed cell death 4 （PDCD4） mediates the sensitivity of gastric cancer cells to TRAIL-induced apoptosis by down-regulation of FLIP expression [J]. Experimental Cell Research（IF 3.557），2010，316（15）：2456-2464.

[13] Kevin W，Yvonne D，Paola C，et al. Endothelial apoptosis in pulmonary hypertension is controlled by a microRNA/Programmed Cell Death 4/Caspase-3 Axi [J]. Hypertension，2014，64（1）：185-194.

（收稿日期：2015-02-20 本文編輯：任 念）