miRNA—181a及其靶基因共濟失調—毛細血管擴張突變基因在胃癌組織中的表達及意義

張向陽等

[摘要] 目的 觀察胃癌組織中微小RNA-181a（miR-181a）與其靶基因共濟失調-毛細血管擴張突變基因（ATM）的表達與異常情況，初步研究其意義。 方法 收集2009年4月～2011年12月廣州市第一人民醫院外科手術切除的胃癌組織標本9例，同時選取其癌旁非癌組織標本作為對照，分析胃癌組織中miR-181a與ATM蛋白表達的相關性。提取其蛋白質及總RNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測標本的miR-181a，Western blot檢測ATM蛋白。比較胃癌組織及癌旁非癌組織中miR-181a、ATM蛋白表達量。 結果 miR-181a在胃癌組織中的表達量為（1.981±1.800），miR-181a在鄰近非癌組織中的表達量為（0.394±0.093）；灰度值檢測：癌組織ATM蛋白為（0.2539±0.0046）；非癌組織為（0.5525±0.0660），癌及非癌組織中miR-181a、ATM蛋白表達量比較，差異均有高度統計學意義（P < 0.01）；miR-181a與ATM蛋白表達呈負相關（r=-0.539，P < 0.01）。 結論 miR-181a在胃癌組織中表達明顯增高，ATM蛋白表達明顯下降；究其原因可能是通過基因沉默機制miR-181a降低ATM蛋白表達量，從而在胃癌的發生及發展中起促進作用。

[關鍵詞] 共濟失調-毛細血管擴張突變基因；胃癌；微小RNA；miR-181a

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0024-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of microRNA （miRNA）-181a （miR-181a） and its target gene ATM in gastric carcinoma tissues. Methods Tissues of gastric carcinoma and adjacent non-tumorous were collected respectively from 9 patients given surgical operation in Guangzhou First People's Hospital from April 2009 to December 2011. The total RNA and protein were extracted routinely， the miR-181a was detected by Real-time quantitative PCR， ATM protein was detected by Western blot. The expression of miR-181a and ATM protein between gastric carcinoma and adjacent non-tumorous were compared， and the correlation between miR-181a and ATM protein levels in gastric carcinoma was analyzed. Results In gastric carcinoma tissues， the expression of miR-181a and ATM protein were （1.981±1.800）， （0.2539±0.0046） respectively， whereas in the adjacent non-tumorous tissues， the expression of miR-181a and ATM protein were （0.394±0.093）， （0.5525±0.0660） respectively. The differences between the expression of miR-181a and ATM protein in these two tissues were statistically significant （P < 0.01）. There was a negative correlation between miR-181a and ATM protein levels （r=-0.539， P < 0.01）. Conclusion The expression of miR-181a is significantly up-regulated in gastric carcinoma tissues， whereas the ATM protein is markedly decreased. miR-181a may inhibit ATM expression by post-transcriptional gene silencing to restrain gastric carcinoma occurrence and progress.

[Key words] ATM； Gastric cancer， micro-RNA； miR-181a

微小RNA（microRNA）是一類非編碼小分子 RNA，存在于真核生物中，長度約為22個核苷酸，有高度的進化保守性，以堿基互補配對原則與靶基因mRNA結合，從而引起靶基因mRNA的降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，進而在轉錄后完成對基因表達的調控，在多種腫瘤的發生發展過程中作為一類潛在的癌基因或抑癌基因發揮作用[1-2]。作為miR-181家族新成員，miR-181a是近期才發現的一個micro-RNA，它在胸腺細胞中表達上調，而在人白血病K562細胞及神經膠質瘤中表達下調，在許多疾病中，如慢性淋巴細胞性白血病、非小細胞肺癌和惡性膠質瘤等諸多疾病的研究方面較多且較為深入，但在胃癌研究方面的報道甚少。共濟失調-毛細血管擴張癥突變基因（Ataxia-telangiectasia mutated gene，ATM）被認為是一種抑癌基因[3-5]，ATM的基因突變增加癌癥患者的易感風險，最初的研究在乳腺癌和胃癌[4，6-7]和ATM蛋白能抑制人類乳腺上皮細胞的惡性轉化[8]。ATM和P53都是參與細胞周期檢查點調節的癌癥易感基因[9-10]，在DNA損傷反應時，這個350 kD的蛋白激酶在G1、S、G2期至關重要[7，11]。此基因產物被認為參與并加強了P53在基因轉錄、調亡和DNA損傷修復方面的功能[4，12]。ATM功能缺失損害其維持DNA穩定性的功能，從而導致癌變，這可能由于ATM基因突變，啟動子甲基化，激酶失活造成[5-6，8]。磷酸化的ATM（活性形式）在胃癌組織中的表達下調[5]，而大多數人的正常組織（包括胃）包含ATM的非磷酸化形式[13]。盡管目前研究觀察到在胃癌組織中有ATM基因的表達下降，但其隱含的深層次的作用機制仍不明了。本研究觀察了miR-181a與ATM蛋白在胃癌組織中的表達情況，為研究miR-181a與其靶基因ATM存在的深層次的調控關系提供了充分的實驗依據。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2009年4月1日～2011年12月1日廣州市第一人民醫院外科手術切除的胃癌標本9例，同時選取其癌旁非癌組織標本作為對照。通過病理專家確定所選胃癌標本均為中晚期胃癌，且入選患者術前均未行放、化療等治療。配對的癌旁非癌組織取其距胃癌癌灶邊緣5 cm以上，術后經液氮速凍保存在-80℃冰箱。本研究經廣州市第一人民醫院醫學倫理委員會通過，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 靶基因的預測

運用3個生物信息學預測軟件，預測miR-181a的靶基因。MiRanda、PicTar及TargetScan。

1.3 引物設計及合成

在miRNA Base數據庫和GeneBank數據庫中基因序列的查找，引物設計采用Primer express 2.0軟件。內參照U6及miR-181a由丹麥生物工程公司Exiqon設計、合成。

1.4 檢測miR-181a

采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）技術。用Trizol提取總RNA，95 μL RNase-free ddH2O加總RNA 5 μL（總RNA可稀釋20倍），應用紫外分光光度計，選擇RNA為測定參數，稀釋倍數設為20倍，調零校正用比色皿中加100 μL RNase-free ddH2O，稀釋后的總RNA在比色皿中實施定量檢測，樣本OD260/OD280的比值可同時檢測。若OD260/OD280=1.9～2.1則提示純度很好；OD260/OD280<1.9則提示DNA有污染；若OD260/OD280>2.1提示有部分標本降解。總RNA完整性的檢測：用凝膠成像系統觀察總RNA的28、18 s和5 s 3個條帶，總RNA抽提較完整則3個條帶完整。第一鏈互補DNA（cDNA）的合成：qRT-PCR采用MJ Research系列qRT-PCR儀，Opticon Monitor 2為操作系統，按照miRNA逆轉錄試劑盒（EXIQON公司）的操作說明，qRT-PCR試劑購自EXIQON公司（丹麥），采用標準曲線法。根據反應體系中得到的Ct值，分別計算出9例胃癌組織和配對的癌旁非癌組織中的miRNAs的相對拷貝數（2-ΔΔCt），相對值=癌組織的校正值/非癌組織的校正值，校正值=目的基因定量結果/內參U6定量結果。

1.5 ATM蛋白檢測

應用免疫印跡（Western blot）方檢測法ATM蛋白，具體方法：稱取100 mg組織標本，放置于高壓滅菌后的研缽上，液氮研磨成組織勻漿，后加1 mL蛋白提取液，經超聲破碎5 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集總蛋白。測定蛋白濃度：取總蛋白50 μg，加凝膠上樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白完全變性。分離蛋白并原位電轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉處理該膜后，分別與ATM一抗及二抗[Rabbit Anti-Mouse IgG （H+L），稀釋倍數：1∶4000]和GAPDH優質內參（HRP標記）孵育。最后顯影。

1.6 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；采用Spearman相關系數進行相關性分析，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在胃癌組織中miR-181a的表達量為（1.981±1.800），在鄰近非癌組織中miR-181a的表達量為（0.394±0.093）（圖1）；ATM蛋白在癌組織中的灰度值為（0.2539±0.0046），癌旁非癌組織灰度值為（0.5525±0.066）（圖2）。miR-181a、ATM蛋白在癌及非癌組織中的表達量比較，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）（圖3）。miR-181a與靶基因ATM蛋白的表達呈負相關（r=-0.539，P﹤0.01）（圖4） 。

3 討論

近年來越來越多的實驗研究表明，miRNA在人類多種惡性腫瘤性疾病中多有異常表達[14-16]。然而對胃癌組織中miRNA的異常表達及作用機制，目前還不甚清楚。為更深入了解在腫瘤性疾病發病中miRNA發揮的作用，尋找腫瘤特異性較高的miRNA及它們對應的靶基因，學者們進行了大量的卓有成效的工作，可為惡性腫瘤的治療提供新的方法[14，17]。

本研究組前期實驗中通過應用miRNA的基因芯片技術及實時熒光定量聚合酶鏈反應技術，已經發現了許多在胃癌組織中表達異常的miRNA，miR-181a為其中之一。此前已有兩項研究報道在胃癌組織顯中miR-181a的高表達[18-19]，然而在胃癌發病中miR-181a的作用仍未闡明。有研究顯示miR-181a在以下疾病中是下調的：人類原發性膠質母細胞瘤[1，20]、慢淋白血病[21]、急髓白血病[22-23]、非小細胞肺癌[24]和口腔鱗狀細胞癌[25]，同時認為miR-181a充當癌癥抑制基因，可與K-ras[25]、BCL-2[26-27]、PLAG1[22]結合，而發揮其抑癌效應。在乳腺癌[28]、肝細胞癌[2]、多發性骨髓瘤[29]、甲狀腺乳頭狀癌[30]中發現miR-181a高表達，同時作為致癌，與靶基因如OPN[31]、CDX2、GATA6、NLK[2]、RASSF1A、TIMP3[32]、PCAF[29]、THRB[30]和uPA[33]結合而發揮作用。在胃癌組織中，與其配對的癌旁非癌組織比較，miR-181a表達顯著上調，提示在胃癌發病過程中miR-181a可能作為一個重要的癌基因而參與其中。之前本研究在人胃癌細胞株SGC-7901細胞中，用miR-181a Inhibitor（抑制質粒）和陰性對照質粒，進行了沉默表達miR-181a的研究。通過進行細胞凋亡、細胞增殖、克隆形成、流式細胞、細胞遷移和侵襲等實驗研究，結果提示沉默miR-181a的表達可顯著抑制SGC-7901細胞的增殖活性，也可明顯抑制SGC-7901細胞的遷移及侵襲能力，同時可促進SGC-7901細胞的凋亡，但與細胞周期無關。鑒于miR-181a在胃癌組織及胃癌細胞株（SGC-7901細胞）中表達均有上調，本研究推斷miR-181a表達的下調可抑制胃癌細胞的惡性表型。

ATM基因被廣泛認為是一種與P53相提并論的重要的抑癌基因[3-5]，ATM的基因突變增加癌癥患者的易感風險。此基因產物被認為參與并加強了P53在基因轉錄、調亡和DNA損傷修復方面的功能[4，12]。ATM功能缺失損害其維持DNA穩定性的功能，從而導致癌變，這可能由于ATM基因突變、啟動子甲基化，激酶失活造成[5-6，8]。磷酸化的ATM（活性形式）在胃癌組織中的表達下調[5]，而大多數人的正常組織（包括胃）包含ATM的非磷酸化形式[13]。盡管目前在胃癌組織中ATM基因的研究較多，但其下調的機制仍無統一的共識，而通過本研究發現了miR-181的表達上調，并在轉錄后水平抑制ATM基因的表達可能是其作用機制之一。

本研究發現miR-181a在胃癌組織中的表達上調，而ATM基因在胃癌組織中表達下調。miR-181a在胃癌組織中的表達和ATM基因的表達呈負相關，miR-181a通過對ATM基因的負性調控，使其對胃癌細胞增殖和轉移潛能產生影響。基于這些結論，結合是個研究組前期的研究成果，聯系了miR-181a與胃癌增殖及轉移潛在的相關性及ATM基因與miR-181a表達水平之間的負性相關。本研究認為：在胃癌發病復雜的過程中，先有miR-181a的高表達（相當于癌基因激活）引起了ATM蛋白的表達下調（相當于抑癌基因失活），從而影響了胃癌細胞功能變化，如遷移、侵襲、增殖和凋亡等（基因沉默），從某種程度上導致了胃癌的發生及發展，由此推斷出在胃癌發病過程中miR-181a起致癌基因作用，其和靶基因ATM基因的鑒定，對了解胃癌發生及發展的分子機制有很大的幫助，從而為人類治療胃癌提供一個理想的靶標。

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（收稿日期：2015-02-22 本文編輯：任 念）