分子檢測(cè)顯示6個(gè)彩色馬鈴薯品種為常規(guī)品種

田雨，何歡，賀蕾

（1.湖北省武昌實(shí)驗(yàn)中學(xué)，430060；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北馬鈴薯工程技術(shù)研究中心）

分子檢測(cè)顯示6個(gè)彩色馬鈴薯品種為常規(guī)品種

田雨1，何歡2，賀蕾2

（1.湖北省武昌實(shí)驗(yàn)中學(xué)，430060；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北馬鈴薯工程技術(shù)研究中心）

本研究收集了6個(gè)彩色馬鈴薯品種，根據(jù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR），用馬鈴薯轉(zhuǎn)基因常用35S啟動(dòng)子和篩選標(biāo)記卡那霉素基因特異引物分析了彩色馬鈴薯是否為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯品種。試驗(yàn)結(jié)果表明，6個(gè)彩色馬鈴薯品種PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，表明這些彩色品種并非轉(zhuǎn)基因品種，這些品種實(shí)際上是經(jīng)過(guò)常規(guī)雜交選育而成。

彩色馬鈴薯；轉(zhuǎn)基因；分子檢測(cè)

馬鈴薯富含大量?jī)?yōu)質(zhì)淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)和人體必需的8種氨基酸，富含維生素C和多種B族維生素，鈣、磷、鎂、鉀含量也很高，還含有微量元素，是一種健康營(yíng)養(yǎng)的蔬菜[1]。隨著我國(guó)人民生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，馬鈴薯越來(lái)越受到廣大消費(fèi)者和市場(chǎng)的青睞。近年來(lái)一些彩色馬鈴薯在市場(chǎng)上流行起來(lái)，彩色馬鈴薯含有大量的純天然花青素和綠原酸等多酚類抗氧化活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老功能，是集營(yíng)養(yǎng)、保健和天然色素于一體的新品種，成為很多消費(fèi)者追捧的健康美食[2]。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，一些轉(zhuǎn)基因植物被釋放。目前我國(guó)共批準(zhǔn)發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因作物安全證書(shū)，分別是抗蟲(chóng)棉花、改變花色矮牽牛、耐儲(chǔ)存番茄、抗病辣椒、抗病番木瓜、轉(zhuǎn)植酸酶玉米和抗蟲(chóng)水稻[3]。但實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)的只有抗蟲(chóng)棉和抗病毒木瓜，抗病辣椒和耐儲(chǔ)存番茄在生產(chǎn)上并未被消費(fèi)者接受，故未實(shí)現(xiàn)商業(yè)化種植，而抗蟲(chóng)水稻和轉(zhuǎn)植酸酶玉米未完成后續(xù)的品種審定，未進(jìn)行商業(yè)化種植[3]。

轉(zhuǎn)基因一般用農(nóng)桿菌作表達(dá)載體，載體上有一個(gè)可轉(zhuǎn)移“T-DNA”區(qū)段，該區(qū)段最后插入植物基因組中，轉(zhuǎn)基因過(guò)程會(huì)在植物基因組中留下“痕跡”[4，5]。一般在“T-DNA”區(qū)段包含2個(gè)表達(dá)框架，一個(gè)是在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的目的基因表達(dá)框架，一個(gè)是選擇標(biāo)記基因表達(dá)框，馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究一般用卡那霉素抗性基因。理論上馬鈴薯轉(zhuǎn)基因如果用了35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因，轉(zhuǎn)基因植株中就會(huì)含有這些區(qū)段。分子檢測(cè)手段是國(guó)際上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定的通行做法。

因?qū)D(zhuǎn)基因技術(shù)不了解或存在安全顧慮，再加上一些不明真相的人有時(shí)散發(fā)一些謠言，到處傳播彩色馬鈴薯是通過(guò)轉(zhuǎn)基因得到的，廣大民眾為此產(chǎn)生困惑。盡管世界上一些科學(xué)家正在進(jìn)行馬鈴薯轉(zhuǎn)基因研究，但目前世界上還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因馬鈴薯獲得環(huán)境釋放和大面積栽培。為了釋疑公眾對(duì)彩色馬鈴薯是否是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的疑惑，選了6個(gè)彩色馬鈴薯品種或品系，利用靈敏的分子生物學(xué)方法通過(guò)探測(cè)“痕跡”有無(wú)來(lái)確認(rèn)品種是否為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為6個(gè)馬鈴薯品種，分別為紫云1號(hào)（紫皮紫肉）、轉(zhuǎn)心烏（紫皮紫肉）、華彩1號(hào)（紅皮紅肉）、黑玫瑰（紫皮紫肉）、River John Blue（紫皮紫肉）、Purple Congo（紫皮紫肉），均為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北馬鈴薯工程技術(shù)研究中心保存，對(duì)照為早大白（白皮白肉）和夏波蒂（黃肉）。

1.2 塊莖DNA抽提

從每個(gè)洗凈的馬鈴薯薯塊上用打孔器取下一個(gè)長(zhǎng)條，切取100 mg薯肉放于2 mL離心管中，然后加入2%CTAB DNA抽提緩沖液300 μL（2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0），4 μLβ-巰基乙醇，放入1個(gè)小瓷珠，用磨樣機(jī)進(jìn)行破碎，5 m/s×5 s 3次，破碎完后在65℃水浴鍋中水浴1 h，期間每隔15 min搖動(dòng)1次。待冷卻至室溫后，12000 r/min離心10min，吸取上清液，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）輕輕搖動(dòng)混勻，12 000 r/min離心15 min。吸取上清液到新的1.5 mL離心管中，加入等體積冰冷的異丙醇，搖勻，-20℃沉淀1 h。12 000 r/min 4℃離心10 min，去上清液，可見(jiàn)離心管底部有白色沉淀，用1 mL 75%乙醇洗滌沉淀1～2次，室溫下干燥，溶于100 μL ddH2O中。最后用電泳方法檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計(jì)：35S啟動(dòng)子（35S-F：5'-CAGAACTCGCCGTAAAGACT-3'，35S-R：5'-GCGTCATCCCTTACGTCAGTG-3'，產(chǎn)物430 bp）和卡那霉素抗性基因特異引物（NPTⅡF：5'-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3'，NPTⅡR：5'-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3'，產(chǎn)物676 bp）進(jìn)行擴(kuò)增。β-tubulin特異引物（Tub-F：5'-TGGACAGTCTGGTGCTGGGA-3'和Tub-R：5'-GCCAGGGAATCTCAAACAG-3'，產(chǎn)物456 bp）作為檢測(cè)PCR反應(yīng)的內(nèi)參。

PCR擴(kuò)增：在PCR管中加入各種試劑，20 μL體系：10×Buffer with MgCl22 μL，dNTPs（2 mmol/L）2 μL，左右引物（2 mmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，不足部分用ddH2O補(bǔ)充。最后滴1滴礦物油覆蓋，放在Biometra II PCR儀上自動(dòng)擴(kuò)增，擴(kuò)增循環(huán)：預(yù)熱95℃，5 min；變性94℃，30 s；退火56℃，30 s；延伸72℃，1 min；32個(gè)循環(huán)（變性-退火-延伸）；最后一次延伸72℃，5 min；保育10℃，停止。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA抽提與檢測(cè)結(jié)果

馬鈴薯DNA抽提完畢溶解于ddH2O中，由于抽提薯塊有色素，抽提DNA沉淀溶解后稍有一些顏色。取出8 μL電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，所有材料都有一個(gè)亮帶（圖1），確認(rèn)所有馬鈴薯DNA都抽提成功。將DNA稀釋10倍用于PCR擴(kuò)增。

2.2 35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因特異引物擴(kuò)增結(jié)果

以提取的總DNA為模板，用植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)轉(zhuǎn)載體pBI121空載體（載體上含有35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因）為陽(yáng)性對(duì)照，分別以35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因特異引物擴(kuò)增。圖2表明，8個(gè)馬鈴薯中都可以擴(kuò)增出β-tubulin特異條帶，表明PCR擴(kuò)增反應(yīng)正常。陽(yáng)性對(duì)照可以擴(kuò)增出35S啟動(dòng)子和NPTⅡ基因特異條帶。但是8個(gè)馬鈴薯包括彩色馬鈴薯中并未擴(kuò)增出產(chǎn)物，說(shuō)明6個(gè)彩色馬鈴薯和另外2個(gè)常見(jiàn)栽培品種都不含35S啟動(dòng)子和NPTⅡ基因。

3 討論與結(jié)論

本研究利用靈敏的分子生物學(xué)方法通過(guò)探測(cè)“痕跡”35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因的有無(wú)來(lái)確認(rèn)品種是否為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。研究結(jié)果顯示，收集的6個(gè)彩色馬鈴薯和2個(gè)常規(guī)品種一樣，35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因特異引物擴(kuò)增都為陰性，表明它們都不是轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。

馬鈴薯起源于南美安第斯山脈，具有豐富的遺傳多樣性[6]。在馬鈴薯的故鄉(xiāng)秘魯，馬鈴薯塊莖皮色和肉色多樣，有黃色、紅色、藍(lán)紫色、紫羅蘭色以及粉色等。多種顏色的馬鈴薯堆在一起，看上去五彩繽紛，像是五顏六色的海洋。馬鈴薯不僅顏色多樣，而且薯形也是千奇百怪，有圓形、長(zhǎng)形，也有的像手掌、有的彎鉤狀、有的螺旋形，表現(xiàn)出極大的多樣性

圖1 8個(gè)馬鈴薯品種抽提DNA電泳檢測(cè)

圖2 35S啟動(dòng)子和卡那霉素抗性基因特異引物擴(kuò)增

圖3五彩繽紛的馬鈴薯（圖3）。在安第斯山脈，有許多原始栽培品種本來(lái)就是色彩斑斕[7]。只是馬鈴薯從安第斯山脈向外傳播時(shí)，只有極少數(shù)品種被引種到歐洲和世界各地。在傳播過(guò)程中只有極少數(shù)彩色品種傳入我國(guó)，因此缺乏多樣性。國(guó)內(nèi)人們習(xí)慣了馬鈴薯比較單一的性狀，對(duì)五彩繽紛的馬鈴薯世界并不了解，因此，一見(jiàn)到薯肉為彩色的馬鈴薯就誤以為是轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。近年來(lái)我國(guó)一些育種單位開(kāi)始重視彩色馬鈴薯的選育，通過(guò)引種和雜交育種也培育出了一些品種，例如云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成紫云1號(hào)，西北農(nóng)林科技大學(xué)育成玫瑰系列彩色馬鈴薯新品種等，這些彩色馬鈴薯都是用常規(guī)育種技術(shù)育成。因此消費(fèi)者沒(méi)有必要擔(dān)心彩色馬鈴薯品種為轉(zhuǎn)基因馬鈴薯。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種是未來(lái)科技發(fā)展趨勢(shì)，當(dāng)然也應(yīng)關(guān)注轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全問(wèn)題，但是人們應(yīng)該用科學(xué)的眼光公正看待轉(zhuǎn)基因植物，全盤(pán)否定、談轉(zhuǎn)基因植物就“色變”的做法是不科學(xué)的。科學(xué)家有義務(wù)向公眾科普轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而公眾有知情權(quán)和選擇是否消費(fèi)轉(zhuǎn)基因食品的自由與權(quán)利。參考文獻(xiàn)

[1]呂巨智，染和，姜建初.馬鈴薯的營(yíng)養(yǎng)成分及保健價(jià)值[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2009（3）：51-52.

[2]李倩，柳俊，謝從華，等.彩色馬鈴薯塊莖形成和貯藏過(guò)程中花色苷變化及抗氧化活性分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（7）：1 309-1 317.

[3]國(guó)家農(nóng)業(yè)生命科學(xué)技術(shù)科普基地.轉(zhuǎn)基因作物與我們的生活[M].北京：科學(xué)出版社，2011.

[4]何光源.植物基因工程[M].北京：清華大學(xué)出版社，2007.

[5]顏啟傳，曹立勇，魏興華.植物轉(zhuǎn)基因品種鑒定的原理與技術(shù)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，2007.

[6]CIP.Cross-Cutting Efforts Optimize Food Security,Nutrition and Livelihood[M].Lima:International Potato Center, 2015.

[7]國(guó)際馬鈴薯中心.秘魯萬(wàn)卡約本地馬鈴薯品種目錄[M].劉作易，雷尊國(guó)，范士杰，譯.貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2010.

Six Colored Potatoes Identified as Conventional Varieties through Molecular Detection

TIAN Yu1,HE Huan2,HE Lei2

(1.Wuchang Experimental High School in Hubei,Wuhan 430061; 2.Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province,Huazhong Agricultural University)

In recent years,colored potatoes became popular among the market.The tuber flesh color of colored potatoes changed from red to purple,colored potatoes contained plenty of anthocyanin with the functions of antioxidant and antiaging which became healthy food loved by consumers.But some consumers‘worries are these colored potatoes are transgenosis potatoes.In this paper,we collected six colored potato varieties,took the polymerase chain reaction technique based on GM technology.We analyzed whether colored potatoes were transgenic potatoes due to the primers of common 35S promoter and selection marker kanamycin gene.The results showed that PCR amplifications of six colored potato varieties were negative,it conducted that these colored varieties were not transgenic varieties,they were bred by conven tional hybridization mode.

Colored potato;Transgenic;Molecular identification

S532

A

1001-3547（2015）20-0043-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.017

田雨（1998-），女，湖北省武昌實(shí)驗(yàn)中學(xué)高二（理科4班），

E-mail：1832480116@qq.com

何歡（1993-），女，通信作者，碩士研究生，主要從事馬鈴薯資源研究，E-mail：284624399@qq.com

2015-07-16