利用SSR分子標記初步分析廣西莪術種質資源的遺傳多樣性

楊妮　王建

摘要：利用簡單重復序列分子標記技術對廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）種質資源進行了遺傳多樣性分析。結果表明，篩選出的14對引物在50份廣西莪術種質資源中共擴增出78個條帶，其中60條呈現多態性，多態性比率為76.92%，反映出廣西莪術種質資源在分子水平上存在較大的差異；廣西莪術不同種質資源間的差異主要由遺傳因素決定，但也與環境因素有關。聚類結果將50份廣西莪術種質資源分成2大類，揭示了它們之間的遺傳差異，這為今后廣西莪術優良品種的選育提供了依據。

關鍵詞：簡單重復序列分子標記；廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）；遺傳多樣性

中圖分類號：Q943.2；Q949.71+8.33；Q16 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2408-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.027

廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F.Liang）為姜科（Zingiberaceae）姜黃屬（Curcuma L.）植物，以干燥根莖入藥，其味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的功效，可用于癥瘕痞塊、淤血閉經、食積脹痛等病征以及早期宮頸癌的治療，是中醫臨床上較為常用的活血化瘀藥材[1]。現代藥理研究表明，廣西莪術所含的莪術油是一種很有發展前途的抗腫瘤、抗血栓和抗病毒藥物[2-4]。廣西莪術是廣西壯族自治區主產的地道藥材，產區面積大，近年來關于莪術揮發油成分的研究越來越多，但對廣西莪術的品種選育和種植技術改良未受到應有的重視。多年來，廣西莪術育種工作側重于常規技術，許多分子水平上的研究工作有待開展。試驗利用簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）分子標記技術對產自于廣西壯族自治區的50份廣西莪術種質資源進行了遺傳多態性分析，旨在揭示廣西莪術種質資源的遺傳多樣性，以期為廣西莪術選育高產優質新品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試廣西莪術種質材料共有50份，是從多年收集到的廣西莪術原始材料中選育出來的，分別采自廣西壯族自治區的玉林市、興業縣、欽州市、靈山縣、貴港市、桂平市、平南縣、欽北區、橫縣、邕寧區、金秀瑤族自治縣等地，從2000年起集中栽植于南寧市仙葫種植基地內。試驗前其生長狀況優良，有關信息見表1。經王建教授鑒定，并經過藥材性狀數據分析，參試的各樣品確認為姜科植物廣西莪術無疑。

1.2 基因組DNA提取

選取參試各種質材料生長狀況良好的新鮮健康嫩葉，經前期消毒處理后提取DNA，提取方法參照經典的CTAB法[5]，稍加改良。提取所得總DNA于-20 ℃環境里保存。

1.3 引物篩選和SSR-PCR反應體系優化

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）擴增引物參照文獻[6]公布的姜黃屬通用的17對引物選取，由上海生工生物技術工程服務有限公司合成，詳見表2。隨機選用10個參試的廣西莪術種質材料，參照Komatsu等[7]的SSR擴增條件稍加改良進行引物篩選，從姜黃屬通用的17對引物中選取擴增條帶清晰、重復性好、多態性高的15對引物作為本次試驗的引物。最終確定的PCR反應體系為：DNA模板3 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 6 μL（Taq DNA Polymerase）、Recombinant 0.05 units/μL、MgCl2 4 mmol/L、dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）0.4 mmol/L、加dd H2O至15 μL。以此建立的SSR反應體系穩定、重復性好。PCR反應程序參照文獻[8]，略有改動；擴增反應是在德國Biometra TProfessional PCR儀上進行，擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個擴增循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 凝膠電泳與染色

PCR產物在7%的聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE，5 μg/mL）中于200 V穩壓里電泳45～60 min，凝膠電泳分離后進行銀染，觀察，并用Cano Scan 9 000 F掃描儀掃描得到圖譜。

根據圖譜分析各SSR位點的擴增情況，包括是否擴增、各位點在不同材料中所得到的等位基因數量。

1.5 遺傳多樣性分析

電泳擴增結果直接記錄凝膠帶型，并按基因型分別統計。選取清晰可辨的電泳條帶，每條帶代表引物與模板的1個結合位點，視每個多態性條帶為1個等位基因，將觀測到的每條帶視為一個性狀，有此帶時賦值為1，無此帶時賦值為0，將所有試驗數據在Microsft Office Excel 2003軟件里進行標準化處理，統計后將（0，1）矩陣輸入分析軟件里進行數據處理與分析。讀出每對引物在廣西莪術種質材料上產生的條帶總數T、多態性條帶P，并計算多態性條帶比率PPB。多態性條帶比率=多態性條帶數目/條帶總數×100%。采用NTSYS-pc 2.10軟件構建數據矩陣，進行聚類分析。在Simint程序下選擇Dice系數計算50份廣西莪術種質材料間的遺傳相似系數，采用非加權組平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）建立相應的系統樹狀結構，通過聚類劃分類群來完成聚類分析。

2 結果與分析

2.1 姜黃屬通用引物在廣西莪術中的擴增情況

從17對公布的姜黃屬通用引物中，篩選出在供試廣西莪術種質材料中能產生較清晰主帶的引物，共有15對，初步認為這些引物是有效引物，適用于廣西莪術種質材料。利用這些引物對50份廣西莪術種質材料統一進行PCR擴增，結果條帶較清晰且有多態性的出現了14對。圖1、圖2分別為引物SSR-01、SSR-02、SSR-03和SSR-07、SSR-08、SSR-09的PCR擴增銀染后掃描得到的電泳圖譜。

2.2 SSR擴增圖譜分析

利用14對引物對50份廣西莪術種質材料進行多態性分析，結果見表3。從表3可見，14對引物在50份廣西莪術種質材料中，每一條都能擴增出4～7條DNA片段，平均每對SSR引物擴增出了4.29 條，總共擴增出了78條，其中多態性條帶60條，多態性條帶比率為76.92%。這個結果表明，廣西莪術各產地間種質材料（居群）的多態性較豐富，這與國外相關文獻報道的印度姜黃（Curcuma longa L.）的擴增效果相近[9]，而國內姜黃屬種群之間在遺傳差異相關研究方面與國外研究相比，所得到的多態性位點總數要略低一些[10-12]。

試驗結果表明，50份廣西莪術種質材料間具有較高的遺傳多樣性，并且廣西各地的廣西莪術種質材料之間的遺傳相似系數差別較大，說明各地的居群存在較明顯的遺傳分化。這和已報道的采用其他分子標記技術研究姜黃屬遺傳多樣性的結果相似，即不同居群的姜黃屬植物種的特性與地理分布具有一定的相關性。王佐元等[13]應用ISSR（Inter-simple sequence repeat）標記技術對5個居群的溫郁金（C. wenyujin Y.H.Chen et C.Ling）遺傳多樣性進行了分析，篩選出6個引物用于ISSR-PCR擴增，結果共檢測到多態性位點34個，多態性條帶比率是80.95%，說明溫郁金有著較豐富的遺傳多樣性。王曉慧等[14]對蓬莪術（C. phaeocaulis Val.）、廣西莪術和溫郁金共8個居群的37個樣本進行了ISSR-PCR分析，5條引物共擴增出65個位點，其中34個位點是多態性位點，多態性條帶比率為52.3 %；據此認為蓬莪術居群間的遺傳變異較大，而居群內部的分化程度很低。本研究結果于上述研究存在相當的一致性。

2.3 UPGMA聚類分析

50份廣西莪術種質材料的SSR擴增條帶統計數據經NTSYS-pc 2.10軟件聚類分析，得到聚類樹狀圖，具體見圖3。從圖3可以看出，在遺傳相似系數0.70處，參試的50份廣西莪術種質材料可聚為2個大類。第一大類包含8份種質，在這一類中，除13-D2-2、86-B94-1、87-B10-2外，其余的都產自玉林市及管轄縣興業縣；其中在遺傳相似系數0.87處，55-玉1-3獨自成為一類，說明55-玉1-3與其他第一大類的廣西莪術種質材料的親緣關系較遠；而在遺傳相似系數0.98處，26-加1和50-玉18-3聚在了一起，這2個材料可能來自同一親本；在遺傳相似系數0.95處，來源于欽州市的86-B94-1、87-B10-2聚在了一起，反映出它們是同一親本產生的后代。第二大類包含42份種質材料，主要來源于平南，貴港，興業，桂平等縣（市），其中在遺傳相似系數0.71處，42份種質又聚為2個亞類。其中來源于金秀縣的37-C46-1，77-C24-1，79-C69-1，80-C104-1聚為1個亞類，與其他種質的親緣關系較遠；其余的38份種質在不同遺傳相似系數處又可聚為多個次類，如在遺傳相似系數0.93處可分為2個次類，第一次類包括了21份種質，分別來源于貴港、桂平、平南等縣（市），這些種質由于所處的地理位置比較接近，因此當地生長環境及種植制度存在一定的相似性，進而也能表現出一定的遺傳相似性。第二次類包括了62-玉22-2、64-C84-3、67-大一-3這3個種質，來自地域較接近的玉林市、興業縣。在遺傳相似系數為1.00處，30-玉24-2、32-玉8-1、32-玉8-2、33-玉3-3、42-玉2-1聚為了1個小類，可以看出這幾份種質的親緣關系非常接近，猜測它們可能是同一株系的后代，它們的產地也相同，均來自玉林市。通過聚類分析圖的完成，可以將無序的50份廣西莪術種質材料進行分類，并能初步確定它們的親緣關系遠近。

3 討論

以往研究表明姜黃屬是三倍體[6]，多態性擴增結果也說明了廣西莪術多倍體資源多態性相對比較豐富。但從聚類樹狀圖來看，50份供試廣西莪術種質材料間的遺傳相似系數介于0.7～1.0，遺傳相似性系數變化范圍較窄；有研究[2，4]認為這與地理、生態環境相近、加之相互引種頻繁等因素有關。此外，試驗所用的引物數量偏少，因此選用的50份廣西莪術種質材料的聚類結果并不能完全反映出不同來源種質間彼此的親緣關系。廣西莪術遺傳背景復雜，通過常規的形態學方法對其進行分類存在一定的局限性。因此，對于廣西莪術遺傳多樣性不僅要結合前期的形態學研究、藥材產量、成分分析研究等方面進行深入探討，還要充分利用近年來快速發展的分子標記技術做深層次的研究。試驗利用SSR分子標記技術。從分子水平上分析了不同來源地廣西莪術種質資源的遺傳多樣性.并對它們之間的親緣關系進行了探討，初步揭示了廣西莪術種質資源之間的遺傳差異，這將對廣西莪術的優良地方品種鑒定篩選與新品種選育提供分子生物學依據。

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