人羊膜間充質細胞的分離培養及其生物學特性探討

丁淑芹 櫻川宣男

1 首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京市 100069； 2 日本生物資源應用研究所

在很多組織中，如臍帶血、骨髓及外周血等組織中存在多分化功能的干細胞，其在細胞移植及組織工程研究中意義甚大。但由于倫理問題、數量來源及移植后免疫排斥等諸多因素限制其在再生醫學領域中的應用。羊膜是隔離胎兒和母體的一種隔膜，具有無血管、無神經、無淋巴等特點。由于：（1）剖腹產后的羊膜是廢棄物，不涉及倫理道德問題；（2）羊膜取材方便；（3）保障充足的細胞來源；（4）羊膜為低免疫源性器官等特點，在再生醫學研究中的意義深遠。人羊膜主要由羊膜上皮（amniotic epithelial cells，hAEC）和羊膜間充質（amniotic mesenchymal cells，hAMC）兩類細胞組成［1］。至今對于這些細胞的功能了解甚少，本研究利用多種酶消化法從人羊膜中分離出高純度的hAMC，并對其生物學特性進行了檢測，以探討其在再生醫學中的價值。

1 材料和方法

1.1 試劑 DMEM （SIGMA）、青－鏈霉素混合液（青霉素100U／ml、鏈霉素100μg／ml）（SIGMA）、Trypsin（SIGMA）、EDTA （DOJIN）、DMEM／F12（SIGMA）、FBS （GIBCO）、2－mercatpethanol（SIGMA）、HEPES buffer（SIGMA）、Recombinant human epidermal growth factor （EGF）（PEPRO－TECH）、Recominant human fibroblast growth factor－basic （bFGF）（PEPROTECH）、Recombinant human leukemia inhibitory factor（LIF）（CHEMICON）、RPMI1640 （sigma，R8758）、agarose（beckman，338400）、兔抗 Musashi 1IgG（abcam）、兔抗Nestin IgG（CHEMICON）、小鼠抗波形蛋白（Vimentin）IgG（SANTA CRUZ）、兔抗Flt－1（C－17）IgG（SANTA CRUZ）、小 鼠 抗 Integrin β1IgG（CHEMICON）、小鼠抗肝細胞核因子（HNF3β、4α、1α）IgG （CHEMICON）、小 鼠 抗 C／EBPαIgG（CHEMICON）、小鼠抗白蛋白（Albumin）IgG（Apllygen）、小 鼠 抗 A1－抗 胰 蛋 白 酶 IgG（AAT）（CHEMICON）、Alexa Fluor rabbit 488（Molecular probe，A－11034）、Alexa Fluor mouse 568（Molecular probe，A－11031）、Human MHC ClassⅡ（Ancell）、Human MHC ClassⅠ（Ancell）。

1.2 方法

1.2.1 hAMC分離。無菌條件下取孕期38～40周剖腹產后的羊膜，用PBS（－）溶液反復沖洗，切成小塊，經 Trypsin－EDTA（PBS 中加入4%Trypsin和1%EDTA）反復處理后，先提取hAEC，剩余的羊膜放入Enzyme溶液（DMEM 培養液加1mg／ml Collagenase、10%DispaseⅡ、0.1mg／ml DNaseⅠ）中，37℃，60min進行消化。羊膜溶化液用細胞篩過濾后，1500r／min離心，5min，去上清，AMC培養液［DMEM／F12（1∶1mixture），10%FBS，1.4%2－Mercaptoethanol，0.01μg／ml EGF stock，0.01μg／ml bFGF，0.1%LIF，加青鏈霉素］混懸細胞，濾器過濾制成細胞懸液，苔盼藍染色后計數，以1×104／cm2數接種于培養皿或培養瓶中。

1.2.2 細胞培養。AMC培養液，在37℃，5%CO2下進行培養，2～3d后細胞黏附在培養皿底面，更換培養液，以清除未貼壁細胞。顯微鏡下觀察其生長情況，每3d換液，細胞長滿后用Trypsin－EDTA消化進行傳代培養。每次傳代時計數細胞數，畫細胞增殖曲線。

1.2.3 免疫細胞鑒定。hAMC細胞（1×104數）培養在24孔培養板內，在37℃，5%CO2下培養24h。3.7%多聚甲醛固定，鼠抗人Vimentin 1抗（1∶50），37℃反應1h，PBS洗3次，加FITC標記羊抗鼠2抗（1∶500），37℃反應1h，PBS洗3次，封片后熒光顯微鏡觀察。其他一抗均1∶50稀釋，二抗1∶500稀釋，方法同上。用熒光激活細胞儀分離法（Fluorescent activated cell sorting，FACS）分析人MHC Class分子。方法：培養中的hAMC用胰酶消化后回收至離心管，離心后去除上清液。用HBSS培養液作懸浮液，并進行細胞計數。將密度1×106／ml細胞懸浮液分裝入2ml的離心管，加入分別稀釋1∶100后的人MHC ClassⅡ和MHC ClassⅠ一抗，在4℃條件下反應1h，加2ml HBSS培養液洗2次。加入相應的熒光標記的二抗（1∶500稀釋），再在4℃條件下反應30min。用HBSS培養液洗3次后進行檢測。

1.2.4 癌化實驗。35mm培養皿，培養液分3層，底層：0.7%agarose／RPMI 1640，中間層：0.5%的agarose／RPMI 1640和1×104細胞混合液（10%FBS），上層：1ml RPMI 1640（10%FBS）。在37℃，5%CO2下進行培養，HeLa細胞做陽性對照，0、1和2周分別進行觀察和拍照。

2 結果

2.1 hAMC生長特性 原代培養細胞24h內開始貼壁，2～3d后觀察細胞呈現梭形或星形形態，此時貼壁細胞呈單個分散或幾個細胞的克隆，貼壁3d后生長迅速，8d左右形成單層，細胞融合成片，細胞形態逐漸均勻，成細長的梭形，輪廓清晰，胞核清晰可見（見圖1）。傳代后細胞24h內完全貼壁，3～4d后生長增殖速度明顯加快，6d左右完全融合，體外培養10代以后，部分細胞的增殖速度明顯減慢，并發生形態變化，變得寬大扁平，失去增殖和分化能力，但多數細胞仍然維持細長的梭形，保持增生和分化能力（見圖2）。

圖1 hAMC細胞形態（A：10×；B：20×；bar＝100μm）

圖2 hAMC的增值曲線

2.2 免疫細胞化學檢查 利用Vimentin和Flt－1抗體進行免疫雙重染色，神經發生相關蛋白Vimentin主要在細胞質中表達，而血管內皮生長因子受體Flt－1主要表達在細胞核中（見圖3），利用同樣的方法對各種與神經、肝臟發生相關的部分因子進行檢測，見表1。

2.3 免疫源性檢測 人羊膜為一種低免疫原性組織，適合同種異體移植治療。FACS檢測結果表明hAMC的MHC ClassⅡ為完全陰性，MHC ClassⅠ為弱陽性（見圖4）。

2.4 癌化實驗 HeLa細胞隨著培養時間的延長，增殖迅速，1周時肉眼可見細胞集落成團，2周時其細胞集落成團明顯增大；而hAMC未見細胞集落成團現象，保持單個生長，1周時細胞數量變化不大，2周時細胞數量逐漸減少，體外實驗提示hAMC傳代培養時保持細胞原有的特性，不具有致瘤性（見圖5）。

圖3 hAMC的免疫染色像（A為位相差；B為Vimentin；C為Flt－1；D為Vimentin和Flt－1合圖）

表1 免疫細胞化學檢測結果

圖4 MHC ClassⅠ／Ⅱ的FACS檢測結果［A：對照組IgG（虛線）和anti－MHC ClassⅡIgG （實線）；B：對照組（實線）和 MHC ClassⅠ（虛線）］

圖5 浮游條件下的癌化實驗hAMC和HeLa培養后0、1、2周時的圖像（10×，bar＝100μm）

3 討論

本研究利用多種酶消化法，從羊膜中分離高純度的hAMC。一般認為間充質細胞是具有高度的自我復制能力并具備多分化潛能的干細胞，但至今無特異性標記來確認其存在。本研究結果表明，hAMC原代培養24h內開始貼壁，72h內細胞呈現梭形或星形形態，此時貼壁細胞呈單個分散或幾個細胞的克隆，貼壁3d后生長迅速，細胞數量成倍增加，提示hAMC具有較強的貼壁性和自我復制能力，并在多種細胞因子的培養環境下，可傳代培養10代以上。

櫻川等證實hAMC表達Musashi和Nestin mRNA，有66%～88%的細胞為Brdu陽性細胞，同時存在分化的β－tubulin和NF－M 陽性細胞，提示hAMC的增殖活性和分化潛能，證實hAMC中存在神經膠質前體細胞的表型［2］。Musashi－1蛋白是一種RNA連接蛋白，在哺乳動物胚胎和成體神經干細胞中表達豐富［3，4］，其主要功能是調控外胚層前體細胞的不對稱分裂，有助于神經干細胞的自我復制［5］。Nestin又稱神經上皮干細胞蛋白，是中樞神經系統主要的中間絲蛋白，表達于發育中的中樞神經系統和骨骼肌，功能與維持神經前體細胞形態結構有關。波形蛋白（Vimentin）是中間絲蛋白的一種，在神經系統發育中的表達有一定的時間性，主要表達于尚未發生終末分化并保留分化潛能的神經祖細胞。Vimentin陽性細胞存在于胚胎及成年哺乳動物的腦室系統和嗅球、海馬和紋狀體等部位［6］。hAMC表達Musashi、Nestin和Vimentin等神經干細胞特異性標記蛋白，由此考慮該細胞具備在一定的條件下誘導分化為神經細胞的潛能。已有報道來源于hAMC的神經前體細胞可用于治療帕金森氏病、神經代謝性疾病及腦腫瘤等中樞性神經系統疾病［7，8］，這些均支持hAMC分化為神經細胞的結果。

肝竇內皮細胞（Sinusoidal endothelial cell，SEC）表達兩種血管內皮細胞生長因子（VEGF）的受體（Flt－1和 KDR／Flk－1），肝臟受損傷后，肝細胞、SEC等細胞分泌、表達VEGF增加，而VEGF介導了SEC的增殖反應［9］。Flt－1含有細胞內的酪氨酸激酶區，不僅可刺激SEC的增殖，而且能誘導SEC細胞的管道生成［10］。正常肝臟組織中還有整合素（Integrinβ1）的表達。肝細胞核因子（HNF）是肝臟發生相關的轉錄因子［11，12］，表明 HNF3β對肝臟的發育和肝干細胞的分化也可能有重要作用，3β在肝臟發生早期表達，并直接促進AAT的表達。4α對肝干細胞分化為肝細胞及肝臟代謝調節等功能起重要作用，4α基因缺失導致異常肝細胞形成，4α促進1α表達，也與3β一起促進AAT的表達。1α是肝特異性基因如白蛋白、α1抗胰蛋白酶、α和β纖維蛋白原的轉錄激活子，可能與維持肝干細胞處于分化狀態有關；1α在肝臟發生后期表達，參與AAT和Albumin的表達。C／EBPα也是與肝臟發生相關的轉錄因子，是細胞合成和積累糖原的必需蛋白質。hAMC表達C／EBPα，說明hAMC有可能具備合成和儲備糖原的能力。羊水中有AAT和Albumin等蛋白質成分，由于hAMC表達肝實質細胞的標志物Albumin和A1－抗胰蛋白酶（AAT），還有組成羊膜的另一種細胞hAEC也表達Albumin和AAT［13］以及羊膜圍繞羊水的結構等，可推定羊水中的Albumin和AAT為羊膜細胞所分泌。Albumin和AAT在羊水中能形成穩定的滲透壓，清除有害蛋白質，保護胎兒。總之，根據hAMC 表達 Flt－1、Integrinβ1、HNF、Albumin和AAT等事實，可以推定在適合條件下可以誘導轉化為成熟的肝細胞。本課題組已證明在一定條件下hAMC可分化為類似人類肝臟細胞的細胞（尚未報告）。hAMC具有糖原合成和儲備及分泌Albumin和AAT功能，也許有助于肝功能障礙及肝臟移植之前的延命措施。

關于羊膜細胞的低免疫源性和羊膜組織移植不易引起免疫排斥反應的事實曾多次被報道［14］。本研究結果也證實hAMC表面不表達主要組織相容性復合體Ⅱ（MHC ClassⅡ），MHC ClassⅠ為弱陽性，前期的流式細胞儀分析也支持相同結果。克服移植后的免疫排斥反應是一種難題，羊膜細胞的低免疫原性特點對于再生醫學領域中的意義重大。由于干細胞具備長時間持續增生的能力，體內移植后可導致腫瘤，也是限制其臨床應用的重要原因之一。本研究結果表明，hAMC在體外癌化實驗中不引起癌化，不具有致瘤性，從此推定在細胞移植研究中hAMC可作為較理想的材料來源。至于hAMC移植后是否引起體內致瘤等問題尚待探討。

總之hAMC為具有多分化潛能的干細胞，其來源充足，具有低免疫源性、自我復制能力強、不涉及倫理問題及無致瘤性等特點，從此在再生醫學研究領域中可作為新的移植細胞來源。hAMC的多分化潛能的細節有待于進一步探討。

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