中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白制備抗氧化肽的研究

高丹丹,蘭家國,趙佩佩,曹 竑

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030)

中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白制備抗氧化肽的研究

高丹丹,蘭家國,趙佩佩,曹 竑

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730030)

藏羊血清蛋白,中性蛋白酶,水解,響應面,抗氧化活性

羊血即牛科動物山羊或綿羊的血,主要成分為多種蛋白質，含少量脂類、葡萄糖及無機鹽等。蛋白質主要是血紅蛋白,其次是血清白蛋白、血清球蛋白和少量纖維蛋白。羊血性平、味咸,入脾經;主要用于各種內出血、外傷出血的食療[1]。近幾年來采用動物血液蛋白源制備生物肽的研究較為活躍,Brant[2]報道從牛血血紅蛋白中分離得到兩種嗎啡肽。任建東等[3]曾報道過在鹿茸血的Alcalase水解物有抗氧化活性和ACE抑制活性;劉騫[4]等人研究了酶水解豬血漿蛋白的工藝條件,獲得具有抗氧化活性的豬血漿蛋白肽。2011年,Adje[5]等采用胃蛋白酶水解牛血紅蛋白得到26段血紅蛋白源抗菌片段,其中13段是新發現的抑菌肽。但目前國內對藏羊血清水解肽的研究較少。本研究在前期研究的基礎上采用中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白,在單因素實驗的基礎上,利用響應面分析法(Response Surface Methodology,RSM)對水解工藝條件進行優化,并對水解產物的抗氧化活性進行分析,為藏羊血清蛋白抗氧化活性肽的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏羊血清蛋白(藏系綿羊血清采取于青海省海西州天峻縣,經真空冷凍干燥,-20 ℃保存待用)。

中性蛋白酶(90000 U/g,中生瑞泰);DPPH、BHT 美國sigma公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚(沒食子酚)、菲咯嗪、Tris等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JA2003N電子天平 上海天平儀器廠;PB-10型精密pH計 Sartorius公司;HWS28型電熱恒溫水浴鍋 西安禾普生物科技有限公司;GL-3250B控溫磁力攪拌器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司;TGL-16M高速臺式冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司;Labconco Freezoneil臺式凍干系統 上海比朗儀器有限公司;6010型紫外分光光度計 美國惠普有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藏羊血清蛋白酶液的制備 準確稱取5 g藏羊血清蛋白,加入100 mL的超純水溶解,調節其至一定pH,加入一定量的酶,在特定的溫度下進行水解,95 ℃滅酶15 min,加入一定量10% TCA后,8000 r/min離心15 min,取上清液待分析用。

1.3.2 水解度的測定 水解度的測定方法采用茚三酮比色法[6],計算公式如下:

式中:As為酶解液中的總游離氨基數,mmol;A1為原料蛋白強酸水解后的總游離氨基數,mmol;A0為原料蛋白中固有的游離氨基數,mmol。

1.3.3 單因素實驗設計 以藏羊血清蛋白水解度(DH)為評價指標,pH為7,反應時間為4 h,溫度為50 ℃的條件下,研究不同[E]/[S](800、1600、2400、3200、4000 U/g)對水解度的影響;在pH為7,反應時間為4 h,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同溫度(分別為30、40、50、60、70 ℃)對水解度的影響。在溫度為50 ℃,反應時間為4 h,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同pH(分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)對水解度的影響;在溫度為50 ℃,pH為7.0,[E]/[S]為2400 U/g的條件下,研究不同反應時間(分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h)對水解效果的影響,確定各因素的最佳水平。

1.3.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,根據Box-Behnken中心組合設計原理,選取溫度、pH、反應時間3個顯著的因素為自變量(分別以A、B、C表示),以水解度為響應值設計了3因素3水平共17個實驗點的響應面分析實驗,因素水平如表1所示,處理數據采用統計軟件Design Expert 8.0完成。

表1 Box-Behnken實驗設計

1.3.5 藏羊血清多肽抗氧化能力的測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 將凍干的多肽粉末配制成1、2、4、6、8 mg/mL的多肽溶液,分別吸取各濃度的多肽液和1%的BHT溶液1 mL于試管中,加入0.4 mmol/L的DPPH自由基溶液(用無水乙醇配制)0.2 mL和2.0 mL的蒸餾水,混勻反應體系,室溫下置于黑暗中反應30 min,517 nm波長處測定其吸光度A1。以等體積的無水乙醇代替DPPH溶液為空白組,記為A2;以同體積的蒸餾水代替樣品溶液為對照組,記為A0。所有測定值均為三次結果的平均值,根據以下公式計算自由基清除率[7]。

式中:A0為對照實驗(水代樣品溶液)的吸光度;A1為樣品實驗吸光度;A2為樣品干擾實驗(無水乙醇代DPPH溶液)的吸光度。

1.3.5.2 羥自由基(·OH)清除能力測定 采用鄰二氮菲法。參考吳淳濤[8]等人的方法并稍加改進。準確量取0.75mmol/L的鄰二氮菲溶液1.0mL于試管中,再依次加入pH為7.4的PBS緩沖液2.0mL以及蒸餾水1.0mL,混勻反應體系,加入1.0mL的0.75mmol/LFeSO4溶液,然后用0.12%的雙氧水(現配現用)1.0mL啟動反應,立即震蕩混勻,記為AP;用同體積的蒸餾水代替0.12%的雙氧水,其余的條件均同AP處理方法,記為Ab;用同體積的多肽液代替1.0mL的蒸餾水,其余條件均同AP處理方法,記為As。三個管AP、Ab、As置于37 ℃水浴鍋中保溫1h,反應結束后,以蒸餾水調零,在536nm波長處測定各管的吸光度,并計算羥自由基的清除率。

式中:Ap為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mLH2O2+1mLH2O的吸光值;Ab為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+2mLH2O的吸光值;As為1mL鄰二氮菲+2mLPBS+1mLFeSO4+1mLH2O2+1mL樣品溶液的吸光值。

式中:A空為空白對照液的吸光值;A樣為樣品溶液的吸光值。

1.4 數據統計分析

采用F檢驗對響應面實驗數據進行方差分析以評價模型的統計意義,數據分析軟件采用DesignExpert8.0和SPSS19.0。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 酶與底物濃度比([E]/[S])對水解效果的影響 不同[E]/[S]對藏羊血清蛋白水解度的影響如圖1所示,水解度隨著加酶量的增加而增加,加酶量800U/g到2400U/g變化的幅度較大。此后,隨著加酶量的增加其曲線上升的趨勢幅度變小。這是因為加酶量在一定范圍內,隨著加酶量的提高,反應體系水解度逐漸上升,當加酶量超出一定范圍后,由于酶濃度逐漸飽和,使酶解速度的增加趨于飽和[10],此時繼續增大加酶量對反應速率無大的影響,且過分的酶解還會產生苦味物質。因此,確定其最適合的加酶量為2400U/g。

圖1 [E]/[S]對水解度的影響Fig.1 Effect of [E]/[S]on the degree of hydrolysis

2.1.2 溫度對水解度的影響 溫度對藏羊血清蛋白水解度的影響如圖2所示,水解度在溫度30～50 ℃隨著溫度的升高而增加,隨著溫度的繼續上升其水解度呈下降的趨勢。此后,隨著溫度的增加其曲線上升的趨勢幅度變小。這是因為溫度對酶促反應的影響一般有兩個方面:一方面是當溫度升高時,反應速度加快;另一方面,隨著溫度的升高,酶逐漸發生了變性,因而反應速度降低,酶促反應的最適溫度就是這兩種過程平衡的結果。在低于最適溫度時,以前一種效應為主;而在高于最適溫度時,以后一種效應為主[11]。在酶解的最初階段,酶變性尚未表現出來,前一種效應占主導地位,所以當溫度低于50 ℃時,水解度隨溫度升高而增加;但當溫度高過最適宜溫度時,酶蛋白變性逐漸突出,后一種效應占主導地位,所以當溫度高于50 ℃時,水解度隨溫度升高反而降低;當酶解溫度為50 ℃時,水解度最大。因此,確定其最適合的溫度是50 ℃。

2.1.3 pH對水解度的影響 pH對藏羊血清蛋白水解度的影響如圖3所示,可知水解度在pH從5.0～7.0隨著pH的升高而增加,之后隨著pH繼續增大其水解度呈下降的趨勢。這是因為每一種酶都有其適合的pH作用范圍,在這個作用范圍內酶的催化活性部位含有的可解離的基團得到了最充分的解離,使酶的活性中心與蛋白質底物充分結合,從而將底物最大程度地轉化為水解產物,使水解度達到最大值,pH偏高偏低都會導致水解度的下降。因此,本研究確定其最適合的pH是7.0。

圖2 溫度對水解度的影響 Fig.2 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

圖3 pH對水解度的影響Fig.3 Effect of pH value on the degree of hydrolysis

2.1.4 時間對水解度的影響 水解時間對藏羊血清蛋白水解度的影響如圖4,隨著時間的延長,水解度逐漸升高。但當水解到5 h后,水解度變化趨于平緩。究其原因,隨著酶解反應的進行:底物濃度減小,反應位點逐漸被酶分子飽和;產物濃度增加,其競爭性抑制變強;酶活性隨反應時間增加會降低;中間復合物[ES]在經歷了初始階段的積累后達到穩態,趨于恒定[12]。從節約時間和能源的角度考慮,確定其最適合的水解時間是5 h。

圖4 時間對水解度的影響Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.2 響應面實驗結果與分析

2.2.1 多元二次模型方程的建立及檢驗 從單因素實驗結果可知,水解度隨著酶添加量的增加而增加,在實際生產過程中酶添加量越多,勢必會增加生產成本,所以在響應面中不考慮酶加量因素,而直接取最適宜的酶加量2400 U/g。選擇對水解度影響最為顯著的三個因素:溫度(A)、pH(B)和時間(C)進行三因素三水平的響應面實驗,實驗設計如表1。中性蛋白酶水解藏羊血清蛋白的響應面分析實驗根據Box-Behnken設計進行了17 組實驗,其中5 組中心點重復實驗,結果見表2。利用Design Expert 8.0采用中心組合實驗 Box-Behnken設計方案,對 pH、溫度、酶解時間三個工藝參數進行優化,獲得二次回歸方程如下:DH=15.42+0.78A+0.050B+1.38C-2.31A2-1.26B2-0.66C2-0.15AB-1.35AC-0.10BC運用響應面回歸程序(Response Surface Regression,RSR)對17個實驗點的響應值進行回歸分析,得到回歸模型的方差分析表3。

表2 Box-Behnken實驗設計及其實驗結果

表3 二次多項模型方差分析表

在回歸方程系數顯著性檢驗表4顯示:A、C、A2、B2和AC這幾個因素對水解度的影響顯著,其中溫度、時間對水解度的影響顯著并且溫度和時間的交互作用也對水解度的影響顯著。

表4 回歸方程系數顯著性檢驗

注:
注:*表示在5%的水平內顯著(0.01

2.2.2 響應面分析與優化 RSM的分析圖是特定的響應值Y對應于因素A、B、C(A為反應溫度;B為反應pH;C為反應時間)構成的一個三維空間的響應面圖在二維平面上的等高線圖,可以直觀地反映出因素對響應值的影響,以及因素之間的相互作用,并且可以看出存在的極值條件應該在等高線的圓心處。等高線的形狀可反映出交互效應的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則表示兩因素交互作用不顯著[13]。通過上述二次多項回歸方程所作的響應曲面圖及其等高線圖見圖5。通過該組動態圖即可對任何兩因素交互影響水解度效應進行分析與評價,并從中確定最佳因素水平范圍。

圖5 兩因素交互作用對水解度的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots for theeffect of operating parameters on the degree of hydrolysis

圖5(a)為固定時間為5h,溫度和pH對水解度的三維響應面和二維等值曲線圖,由圖可知溫度和pH的交互作用不明顯。圖5(b)為固定pH7、溫度與時間對水解度影響的三維響應曲面和二維等值線圖。從圖中可見,溫度和時間的交互作用較為顯著,溫度在40～48 ℃,反應時間在4～5.2 h范圍內,與水解度呈正相關關系,水解度從8.5%上升至15.83%。此后水解度曲線趨于平緩,等值線的間距變寬,繼續增加溫度或延長反應時間對水解度的影響不大。圖5(c)中為溫度為50 ℃、時間與pH對水解度影響的三維響應曲面和二維等值線圖,圖中顯示時間與pH的交互作用不顯著。

2.2.3 模型驗證實驗 根據Box-Behnken實驗所得的結果和二次多項回歸方程,利用Design Expert 8.0軟件獲得了水解度最高時的各個因素的最佳水解條件為最優水解條件為溫度50.27 ℃,水解時間為5.55 h,水解pH為6.78,在此水解條件下,水解度可達到15.91%。為了檢驗模型預測的準確性,在溫度50 ℃,水解時間為5.5 h,水解pH為6.8下進行水解做了3平行實驗所得結果分別為15.05%、15.44%和15.84%,平均值為15.44%,標準偏差(SD)=0.395%,可見該模型能較好地預測實際水解情況。

2.3 藏羊血清蛋白肽的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖6可知,藏羊血清蛋白的中性蛋白酶水解物對DPPH自由基有明顯的清除作用,并且隨著多肽溶液濃度的增大而增大,這說明藏羊血清蛋白多肽對DPPH自由基的清除能力在一定的濃度范圍內有良好的量效關系。當多肽的濃度為8 mg/mL時對DPPH自由基清除率達到最大(76.06±0.74)%,而在相同的系統中1%的BHT的DPPH自由基清除率(98.40±0.43)%。多肽對DPPH自由基的IC50值為6.035 mg/mL。

圖6 DPPH清除能力Fig.6 The scavenging ability of DPPH

2.3.2 羥自由基(·OH)清除能力 由圖7可知,1%的BHT對所建體系的·OH清除率為(90.07±0.66)%,藏羊血清蛋白多肽濃度增大時,對·OH的清除作用明顯增大。當多肽濃度為1 mg/mL時清除率為(24.51±1.37)%,2 mg/mL時清除率為(31.91±1.95)%,4 mg/mL時清除率為(46.70±1.85)%,6 mg/mL時清除率為(59.85±1.42)%,當多肽濃度達到8 mg/mL時清除率為(79.76±0.79)%,多肽對羥自由基的IC50值為3.555 mg/mL。

圖7 羥自由基清除能力Fig.7 The scavenging ability of hydroxyl radical

圖8 超氧陰離子清除能力Fig.8 The scavenging ability of superoxide radical

3 結論

本研究通過單因素實驗,確定了最適加酶量為2400 U/g,最適溫度為50 ℃,最適pH為7,最適水解反應時間為5 h。以此為基礎,并且以水解度為最終評價指標,通過三因素三水平的響應面分析法對蛋白酶水解蛋白的水解條件進行優化,得出最佳的水解條件為:溫度50.27 ℃,水解時間為5.55 h,水解pH為6.78,在此條件下水解度可達到15.91%。并對最佳工藝條件下水解物的抗氧化活性進行分析,結果表明多肽的抗氧化活性和多肽的濃度在一定的濃度范圍內有良好的量效關系,隨著多肽濃度的增大,其抗氧化活性增加,當多肽濃度為8 mg/mL時,其DPPH清除率為(76.06±0.74)%,羥自由基清除率為(79.76±0.79)%,超氧陰離子清除率可達到(77.90±0.67)%。其對DPPH、羥自由基和超氧陰離子的半抑制濃度(IC50)分別為:6.035、3.555和2.872 mg/mL。本實驗明確了藏羊血清蛋白肽的體外抗氧化功能,但其與BHT相比抗氧化能力有很大的差距,由于藏羊血清蛋白的中性蛋白酶水解物是一個復雜的混合物質,可能含有高抗氧化活性的成分,也可能含有無活性的或助氧化的成分,需要進一步的分離純化。對于其具體起作用的功效成分和作用機理,以及相關功能性食品的研究與開發還有待于進一步研究。

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Preparation of antioxidant peptide by hydrolization of tibitan sheep serum protein by neutral protease

GAO Dan-dan,LAN Jia-guo,ZHAO Pei-pei,CAO Hong

(College of Life Science and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China)

Tibitan sheep serum protein was hydrolyzed by neutral protease,the influences of the temperature,hydrolysis time,pH value and the substrate/enzyme ratio on the degree of hydrolysis of Sheep serum protein were investigated. On the basis of single factor tests and response surface methodology,the optimal working parameters were worked out and tested. The optimum hydrolysis parameters were as follows:when the amount of enzyme was 2400 U/g,hydrolyzing 5.5 hours at temperature 50 ℃ under pH6.8,and the degree of hydrolysis was 15.44±0.395% under the optimum conditions. The antioxidant activities of the hydrolysate was measured by the inhibiting effect on the scavenging ability of 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH),hydroxyl radical and superoxide radical. The antioxidant activities increased with increasing concentrations of test samples. The peptides exhibited high scavenging ability of DPPH,hydroxyl radical and superoxide radical with an IC50value of 6.035,3.555 and 2.872 mg/mL respectively.

tibitan sheep serum protein;neutral protease;hydrolysis;response surface;antioxidant activities

2014-10-11

高丹丹(1983-),女,博士,副教授,研究方向:食品生物技術,E-mail:gaodan0322@163.com。

TS254.9

B

1002-0306(2015)15-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.039