海帶中巖藻多糖的抗衰老活性及構(gòu)效關(guān)系研究

李小蓉,張 拴

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西咸陽 712046)

海帶中巖藻多糖的抗衰老活性及構(gòu)效關(guān)系研究

李小蓉,張 拴

(陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西咸陽 712046)

研究海帶中巖藻多糖的抗衰老活性及構(gòu)效關(guān)系。將海帶中巖藻多糖(FSP)經(jīng)分離純化得到三個FSP分離組分(FSP-1、FSP-2、FSP-3),對3個組分進行了元素分析并分別測定各組分分子量及其單糖組成;通過對D-半乳糖致衰老的小鼠給藥,并測定一些與衰老相關(guān)的生化指標(biāo),以研究海帶中3個分離組分的抗衰老活性。結(jié)果表明 FSP-1、FSP-2、FSP-3治療組與模型組比較,FSP-2與FSP-3均使衰老小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯回升(p<0. 01),且FSP-3作用效果更為明顯。3個組分均能顯著升高小鼠血清中超氧化物歧化酶活性,降低丙二醛含量,以及升高全血中谷胱甘肽過氧化物酶活性(p<0. 05或p<0. 01)。說明FSP中3個組分均具有抗衰老活性,各分離組分的抗衰老活性強弱與其硫酸基含量、分子量大小和單糖構(gòu)成有關(guān)。

海帶,巖藻多糖,抗衰老活性,構(gòu)效關(guān)系

藻類是海洋生物活性物質(zhì)的重要來源,已發(fā)現(xiàn)的海洋生物活性物質(zhì)中約40%來自藻類[1]。我國沿海海域有豐富的海帶資源,其藥用價值早在《本草綱目》等古醫(yī)書中已有記載。海帶中多糖主要為巖藻多糖,研究表明,海帶所含的巖藻多糖具有明顯的生理活性,如抗腫瘤、促進造血功能等[2-3]。隨著人們對巖藻多糖的深入研究,得知其并非單一結(jié)構(gòu)的化合物,其組成十分復(fù)雜,稱為含巖藻糖的硫酸多糖(fucose-containing sulfated polysaccharides,FSP)。由于巖藻多糖的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素影響[4],目前國內(nèi)外的報道對其結(jié)構(gòu)組成沒有統(tǒng)一的定義,大多是對其進行初步純化[5],得到巖藻多糖的混合物。國外Maria I. Bilan等[6-8]學(xué)者對巖藻多糖的結(jié)構(gòu)進行了研究,而海帶的深度開發(fā)空間還很大。

本實驗采用陰離子交換纖維素色譜法和凝膠柱色譜法對FSP進行反復(fù)分離純化,得到3個不同組分,比較三者體內(nèi)抗衰老活性實驗,并對各分離組分的抗衰老活性與分子量大小,硫酸基含量及單糖組成之間的關(guān)系進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

海帶(LaminariajaponicaAresch) 產(chǎn)于山東威海市,經(jīng)鑒定為海帶葉片;昆明清潔級小鼠 120只,許可證號:SCXK 豫 20050001,>2月齡,體重(20.0±2.0)g,雌雄各一半;D-半乳糖 張家港思普生化有限公司;超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒、丙二醛試劑盒 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

BS-100N自動部分收集器、BT100N數(shù)顯恒流泵 上海青浦滬西儀器廠;CR22G Ⅱ離心機 日本日立公司;N-1100V-W/WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司;GC-2410氣相色譜儀 日本島津公司;vario EL元素分析儀 德國Elementar Analysensysteme公司;GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津SHIMADZU公司;NEXUS 670傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司;冷凍干燥機 美國Labconco公司;電子分析天平 德國Sartorius公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖藻多糖的提取 日曬干燥的海帶經(jīng)粉碎過篩后,95%乙醇回流脫脂1 h。10倍水量60 ℃下提取2次,時間分別為2、1 h。合并兩次提取液,然后濃縮成一定體積。將濃縮液用濃度為95%乙醇進行沉淀,過濾,沉淀為巖藻多糖粗品(FSP),再用丙酮洗滌2～3次,Sevage法脫蛋白,雙氧水法除去色素。

1.2.2 巖藻多糖的分離純化 取一定量經(jīng)脫色的巖藻多糖(FSP),用蒸餾水溶解后,過DEAE-52柱色譜(2.6 cm×70 cm),分別用含0、0.1、0.3 mol·L-13種不同濃度氯化鈉水溶液進行洗脫,流速為1.0 mL/min,苯酚-硫酸法在480 nm處檢測吸光度值,得到3種組分。這3個組分分別再經(jīng)Sephadex G-100柱色譜(2.6 cm×90 cm),蒸餾水洗脫,最終得到FSP-1、FSP-2、FSP-3共3個組分。

1.2.3 FSP中3個組分的純度鑒定 純度鑒定采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)。色譜柱:TSK色譜柱,流動相:超純水,流速:1 mL·min-1,柱溫:35 ℃,示差折光檢測器溫度:30 ℃。

1.2.4 FSP中3個組分的元素分析 分別對FSP中3個組分中碳(C),氫(H),氧(O),氮(N),硫(S)進行分析。硫酸酯基(OSO2Na,sodium salt)按公式進行計算:硫酸酯含量(%)=3.22×S%。

1.2.5 GPC-MALLS聯(lián)用技術(shù)測定FSP中3個組分的分子量

1.2.5.1 色譜分析條件 采用TSK系列凝膠色譜柱,流動相為0.2 mol·L-1NaNO3溶液,流速為0.8 mL·min-1,柱溫:40 ℃;MALLS的光源氣體為氦氣和氖氣,波長:690.35 nm。流動相的折光指數(shù)取1.350,3個組分在溶液中的折光指數(shù)增量(dn/dc)測得值均近似為0.147,校準(zhǔn)激光的儀器常數(shù)為7.9074×10-6(V cm)-1,校準(zhǔn)示差折光檢測器儀器常數(shù)為2.1403×10-4(V cm)-1。

1.2.5.2 樣品溶液的制備 精密稱取純化組分FSP-1、FSP-2、FSP-3,采用0.2 mol·L-1NaNO3溶液配制成6 mg·mL-1溶液,經(jīng)0.22 μm過慮膜過濾,凝膠滲透色譜-激光光散射聯(lián)用技術(shù)(GPC-MALLS)分析。

1.2.6 FSP中3個組分的單糖組成

1.2.6.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈乙酸酯衍生物的制備 分別稱取葡萄糖(Glc)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)各7 mg,加入10 mg鹽酸羥胺,再加0.5 mL吡啶,90 ℃反應(yīng)30 min,冷至室溫,加入0.5 mL醋酸酐,90 ℃繼續(xù)加熱乙酰化,冷卻后加入1 mL水和1 mL氯仿萃取3次,取氯仿層,揮干,殘渣加1 mL氯仿溶解搖勻,即得標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物。

課堂教學(xué)中，教師要把握好“放”與“收”的度。教師對“放”與“收”的靈活把握，不僅依賴于教師的“才氣自華”“腹有詩書”，還依賴于教師鎮(zhèn)定自若、指揮若定的心態(tài)，而且對這個度的把握還必須符合學(xué)生的年齡層次、心理特點和知識水平，符合教材內(nèi)容、學(xué)生個性等具體情況。這時的教師，就像戰(zhàn)場上指揮千軍萬馬的將軍，只有了解整個局勢的變化，臨危不亂，從容不迫，才可能贏得這場戰(zhàn)斗的最終勝利。

1.2.6.2 多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化 分別稱取FSP-1、FSP-2、FSP-3各10 mg,加入2 moL·L-1三氟乙酸4 mL,121 ℃密閉水解2 h,減壓蒸干,加入甲醇再蒸干,重復(fù)3次,以徹底除去過量的TFA。以后處理與標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物制備過程相同,分別進樣標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物和多糖衍生物,GC分析。

1.2.6.3 氣相色譜條件 程序升溫:120 ℃下保持4 min,然后以5 ℃·min-1升至190 ℃,保持4 min,再以3 ℃·min-1升至210 ℃,保持10 min。進樣口溫度:210 ℃;檢測器溫度:240 ℃[9]。

1.2.7 FSP中3個組分的抗衰老作用的研究

1.2.7.1 給藥 昆明小鼠共分為11組,除正常對照組外,衰老模型組和9個治療組每只頸背部皮下注射50 g·L-1D-半乳糖0.5 mL進行造模,而正常對照組頸背部皮下注射相同劑量生理鹽水。造模完成后,正常對照組和衰老模型組腹腔注射生理鹽水0.5 mL;給予治療組腹腔注射相應(yīng)的劑量體質(zhì)量0.5 mL的FSP組分溶液,連續(xù)一共6周。

1.2.7.2 實驗指標(biāo)測定 小鼠血中指標(biāo)測定:血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量,小鼠全血中谷胱甘肽過氧化物酶的活力。6周過后,將小鼠麻醉再摘除眼球取血,一部分血樣常規(guī)分離血清,在4 ℃條件下4000 r·min-1離心5 min,取上清液測定;另一部分全血待測;丙二醛含量,超氧化物歧化酶活性谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定嚴(yán)格按照試劑盒操作程序進行。

1.2.7.3 免疫器官指數(shù)的測定 6周過后,將小鼠稱重并取下小鼠胸腺和脾臟,采用電子天平稱質(zhì)量,以臟器濕質(zhì)量(mg·g-1)表示小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.2.7.4 評估標(biāo)準(zhǔn) 小鼠每天注射給藥1次,6周后,用紫外可見分光光度計測定小鼠血清中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量及檢測小鼠全血中谷胱甘肽過氧化物酶活力。

1.2.7.6 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理,多組間差異的顯著性檢驗使用方差分析,兩組之間的比較則采用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 巖藻多糖的分離純化

巖藻多糖的分離純化結(jié)果如圖1所示。巖藻多糖用蒸餾水溶解后,過DEAE-52柱色譜,氯化鈉水溶液進行洗脫,苯酚-硫酸法示蹤監(jiān)測,得到3種組分。這3個組分分別再經(jīng)Sephadex G-100柱色譜,蒸餾水洗脫,最終得到FSP-1、FSP-2、FSP-3共3個組分。組分的純度鑒定采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)。樣品純度一般通過峰型進行判斷,通常情況下,如果在凝膠柱填料的排阻極限內(nèi),HPGFC譜中呈現(xiàn)窄的單一對稱峰的多糖組分被認(rèn)為是均一的多糖。FSP中3個組分,經(jīng)HPGPC法檢測,均呈單一對稱尖峰,說明三者均為均一組分。

圖1 FSP中3個組分的DEAE纖維柱層析結(jié)果Fig.1 Elution pattern of crude polysaccharides extractedfrom kelp on DEAE-cellulose column

2.2 FSP中3個組分的元素分析結(jié)果

FSP中3個組分的元素分析結(jié)果如表1所示。由表1可以看出,FSP中3個組分C,H,O的摩爾比均約為1∶2∶1,符合糖類元素組成及比例。根據(jù)硫酸酯含量計算公式得FSP-1、FSP-2、FSP-3中分別為硫酸基含量為12.35%、37.98%、51.19%。

表1 FSP中3個組分的元素分析(%)

天然生物大分子的化學(xué)組成、分子量以及分子鏈構(gòu)象在闡釋構(gòu)效方面十分重要,SEC-MALLS作為一種測定高分子化合物分子量的絕對方法,非常簡便,而且不需要任何標(biāo)準(zhǔn)品。由激光散射儀、示差折光檢測器和紫外檢測器檢結(jié)果中可知FSP中3個組分為單一對稱的尖峰,且經(jīng)GPC-MALLS聯(lián)用技術(shù)測定,FSP-1、FSP-2、FSP-3的重均分子量分別為8.7×104、1.5×105、1.2×105u。

2.3 FSP中3個組分的單糖組成結(jié)果分析

由圖2～圖5及表2可以看出,三個組分均以巖藻糖為主。FSP-2、FSP-3組分與FSP-1相比,具有鼠李糖、木糖、半乳糖,而相比于FSP-2,FSP-3組分,則具有較高含量的鼠李糖。

圖2 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of the sugar standards注:1. 鼠李糖;2. 巖藻糖;3. 木糖;4. 甘露糖;5. 葡萄糖;6. 半乳糖;圖3～圖5同。

圖4 FSP2的氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of FSP-2

圖5 FSP3的氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of FSP-3

表3 FSP中3個組分對D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響(x±s)

注:
注:t檢驗,與對照組比較,**p<0. 01;與模型組比較,ΔΔp<0. 01。

表4 FSP中3個組分對模型組小鼠血清超氧化物歧化酶、丙二醛及全血中谷胱甘肽過氧化物酶的影響(GSH-Px)(x±s)

注:
注:與對照組比較,p*<0. 05;與衰老模型組pΔ<0. 05,pΔΔ<0. 01。

2.4 FSP中3個組分的抗衰老作用

如表3所示,小鼠經(jīng)連續(xù)皮下注射D-Gal 6周以后,胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對照組比較,有所下降,且均具有統(tǒng)計學(xué)意義。注射FSP-1、FSP-2與FSP-3均能使衰老小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)顯著回升(p<0. 01),且均存在一定量效關(guān)系,而且,相比于FSP-1、FSP-2,FSP-3作用效果更為明顯,尤以FSP-3高劑量組小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)升高最為明顯。

表2 FSP中3個組分的單糖種類及摩爾比

注:
注:-表示未檢出。

如表4所示,衰老模型組與正常對照組相比較,小鼠血清中超氧化物歧化酶活性明顯降低,丙二醛含量顯著升高(p<0. 05),此結(jié)果證明衰老模型成功建立。FSP-1、FSP-2、FSP-3治療組與模型組對比,小鼠血清中的超氧化物歧化酶活性均顯著性地升高,丙二醛含量顯著降低,而全血中谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著升高(p<0. 05或p<0. 01)。

3 結(jié)論與討論

衰老自由基學(xué)說由harman[9]提出,該理論闡明了機體內(nèi)時刻會產(chǎn)生自由基,但同時又能有效的清除自由基,使體內(nèi)自由基維持在正常水平。隨著年齡的不斷增長,這種平衡逐漸被打破,造成人體內(nèi)自由基過剩。過多的自由基可與細(xì)胞膜中的類脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng),致使細(xì)胞膜的破壞,從而最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物(如丙二醛)可與DNA蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合,損傷細(xì)胞膜,從而引起神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。在抗衰老中藥的研究中常用的動物模型方法有很多,其中D-Gal致小鼠亞急性衰老模型因其衰老變化明顯,模型穩(wěn)定,在抗衰老研究中得到廣泛應(yīng)用[10]。研究者們認(rèn)為,D-Gal引起的代謝紊亂使人體內(nèi)過氧化反應(yīng)增強,從而引起致老化反應(yīng)[11]。

本實驗D-半乳糖致衰老小鼠行動遲緩,皮毛松散無光澤,體質(zhì)量增加量明顯下降,同時血清中超氧化物歧化酶活性顯著降低,丙二醛水平明顯升高,與有關(guān)報道的結(jié)論相符。本實驗結(jié)果表明FSP中3個組分治療組與衰老模型組比較,小鼠血清中超氧化物歧化酶活性均明顯升高,丙二醛均含量明顯降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義。FSP中3個組分治療組均能明顯對抗D-半乳糖的致老化作用,使體內(nèi)超氧化物歧化酶活性顯著提高,丙二醛水平則明顯下降,因而推測FSP中3個組分治療組可能通過提高超氧化物歧化酶活性,增強其對自由基的清除能力,抑制脂質(zhì)過氧化,降低丙二醛含量,從而減輕對機體組織的損傷以延緩衰老。另外,FSP中3個組分能夠顯著增加小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù),表明它們對小鼠的免疫功能也有調(diào)節(jié)作用。

由于海帶中巖藻多糖一般為硫酸酯化多糖,而硫酸酯化多糖種類繁多,結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性和多樣性,且結(jié)構(gòu)又與生物活性密切相關(guān),其活性受單糖組成、分子量的大小、硫酸基含量及連接位置、多糖的立體結(jié)構(gòu)等多種因素的影響,從而呈現(xiàn)出生理活性的多樣性。本實驗對FSP中3個組分進行多步分離純化,得到3個均一的巖藻多糖。結(jié)合體內(nèi)抗衰老效果的差異,對具有不同生物活性的組分的分子量,硫酸基含量及單糖組成情況進行了初步分析,對D-半乳糖致衰老的小鼠,重均分子量為1.5×105u的FSP-2與重均分子量為1.2×105u的FSP-3具有較高的抗衰老作用,而且FSP-3的抗衰老效果更好,說明抗衰老作用與組分具有適當(dāng)?shù)姆肿恿坑嘘P(guān)。從硫酸基含量上來看,含量最高的FSP-3,具有最強的抗衰老作用。從單糖組成來講,與FSP-1相比,抗衰老作用較強的FSP-2與FSP-3中含有鼠李糖、木糖、半乳糖,具有較高的抗衰老效果,而相比于FSP-2,FSP-3中的鼠李糖含量更高,因此,在單糖組成上,表現(xiàn)出與活性一定的相關(guān)性,即鼠李糖、木糖、半乳糖與FSP的活性強弱密切相關(guān),而且鼠李糖的含量相對越高,抗衰老效果相對越強。上述只是針對海帶中巖藻多糖多糖對對D-半乳糖致衰老的小鼠抑制作用規(guī)律的一個初步觀察結(jié)果,為揭示其構(gòu)效關(guān)系,還需要從更為詳盡的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)上進行大量的實驗來進行解析。

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Study on the effect of anti-aging and structure-function relationship of fucoidan from kelp

LI Xiao-rong,ZHANG Shuan

(College of Pharmacy,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China)

The effect of anti-aging and structure-function relationship of fucoidan from kelp was studied. The fucoidan was extracted from kelp and FSP-1,FSP-2,FSP-3 were purified. Elemental analysis,gel permeation chromatography coupled with multi-angle laser light scattering(GPC-MALLS)and GC analysis were applied to investigate the three components. In order to study the effect of anti-aging of three components from kelp,administered medicine was given to rats with subacute senile model by D-galactose,then some indexes were determined. Compared treatment group with senile model group,indexes of thymus and spleen(p<0.01)were promoted by FSP-2 and FSP-3,moreover,the effect of FSP-3 was more significant than FSP-2. The activity of superoxide dismutase(SOD)and GSH-PX in blood were significantly promoted,but the content of malondialdehyde(MDA)was decreased by three components from kelp. Three components from kelp had the activity of anti-aging,and the activity of anti-aging was in relation with the content of sulfate groups,molecular mass and sugar composition of them.

kelp;fucoidan;anti-aging activity;structure-function relationship

2014-06-25

李小蓉(1979-)，女，碩士，講師，主要從事中藥有效成分的化學(xué)研究工作，E-mail:lxmaill1979@126.com

TS201.2

A

1002-0306(2015)15-0117-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.017