阿米洛利通過抑制uPAR減輕DDS誘導小鼠結腸炎

劉揆亮，王亞丹，鐘嬋娟，吳 靜

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 消化內科， 北京 100038)

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阿米洛利通過抑制uPAR減輕DDS誘導小鼠結腸炎

劉揆亮，王亞丹，鐘嬋娟，吳 靜

(首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院 消化內科， 北京 100038)

尿激酶型纖溶酶原激活物受體(urokinase plasminogen activator receptor, uPAR)是尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)的受體，在多種免疫炎性細胞表面均有表達，參與天然及獲得免疫反應。最近報道uPAR在小鼠實驗性結腸炎中具有重要作用[1]。Na+/H+交換抑制劑阿米洛利可減輕結腸炎癥[2]及抑制uPAR表達[3]。本研究觀察了阿米洛利是否通過抑制uPAR減輕DSS誘導小鼠結腸炎，并對其與VSL#3(八種益生菌混合物)的作用進行了比較。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物及試劑:SPF級BALB/c小鼠20只，雌性，8～10周，體質量18～20 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證SYXK(京)2012- 0024]。葡聚糖硫酸鈉(DSS，美國MP公司)，阿米洛利(Sigma-Aldrich公司)，VSL#3(Sigma-Tau公司)。兔uPAR抗體(Abcam公司，1∶500)。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥及取材:本研究經北京世紀壇醫院生物醫學倫理委員會批準。將小鼠隨機分為對照組(不予處理)、阿米洛利組、VSL#3組及DSS組，每組5只。阿米洛利組，VSL#3組及DSS組自由飲用5% DSS，同時分別給予阿米洛利(10 mg/kg)、VSL#3(5 g/kg)及0.9%氯化鈉溶液每日灌胃。第6日處死動物后取結腸組織。

1.2.2 DAI評分及組織學評分：參照文獻[4- 5]進行疾病活動指數(Disease activity index，DAI)評分及組織學評分。

1.2.3 RT-PCR檢測:提取總RNA，合成cDNA。PCR管內依次加入1 μL反轉錄產物，各基因上游與下游引物各0.25 μL，12.5μL PCR反應混合物，ddH2O水補足體積至25 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸10 min，共35循環。產物電泳后計算相對吸光度。uPAR引物：F：5′-CAAGAGACAACTGAATC CACA-3′；R：5′-GAAAGAAAACCCTTACAAAAC-3′；β-actin引物：F:5′-CAAGAGACAACTGAATCCACA-3′；R:5′-GAAAG AAAACCCTTACAAAAC-3′。

1.2.4 uPAR的免疫組化檢測:切片常規脫蠟置水，pH 6.0檸檬酸緩沖液抗原修復，加一抗后4 ℃過夜，加二抗后室溫30 min，DAB顯色。……