HIF-1α對乳腺癌并發2型糖尿病患者微血管生成的影響

宋秋艷 董瑞鴻

鄭州大學第五附屬醫院內分泌科，河南 鄭州 450000

缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是在缺氧條件下腫瘤細胞產生的一種核轉錄因子，調節細胞適應低氧狀態下的能量代謝和氧的運輸，是體內維持細胞內氧平衡的主要調控因子[1]。HIF-1α在各類癌組織血管生成方面的研究是目前臨床上的熱點[2]，但是其與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、微血管密度（microvessel density，MVD）的關系研究在國內還比較少見。本研究旨在探討HIF-1α在合并糖尿病乳腺癌組織中的表達及其與VEGF和MVD，來研究HIF-1α在乳腺癌組織生長、癌細胞增殖和轉移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年6月～2015年6月在鄭州大學第五附屬醫院接受手術切除治療的乳腺癌合并2型糖尿病的女性患者的乳腺標本蠟塊79例（觀察組）和非糖尿病的乳腺癌患者乳腺標本蠟塊95例（對照組）。兩組患者均為女性，觀察組年齡28～71歲，平均（48.5±9.2）歲，對照組年齡 31～74 歲，平均（47.1±8.8）歲。兩組患者性別和年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有患者在術前均未接受過放化療的治療，全部病例類型均為浸潤癌。患者被明顯確認為乳腺癌患者。診斷標準：通過影像學檢查、組織病理學和細胞病理學檢查，并經過兩名權威乳腺癌診治專家進行鑒別得到確診的乳腺癌患者[3]。

1.2 試劑與儀器

HIF-1α單抗濃縮液、VEGF單抗濃縮液均購自武漢博士德生物科技有限公司；CD34單抗工作液、SP試劑盒、二氨基聯苯胺（DAB）染色劑、HE染色劑均購自福州邁新生物科技有限公司。

1.3 檢測方法

乳腺癌患者石蠟包埋標本共174例，每例蠟塊間斷連續切取4 μm切片5張，選取1張進行常規的HE染色，其他切片進行HIF-1α、VEGF、MVD免疫組化染色。免疫組化染色采用SP法，嚴格按照說明書進行操作，具體步驟如下：①烤片，68℃，20 min。②常規二甲苯脫蠟（二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min），梯度酒精脫水（100%乙醇Ⅰ10 min，100%乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇5 min，80%乙醇5 min，70%乙醇5 min。③阻斷滅活內源性過氧化物酶：3%H2O237℃孵育10 min，PBS沖洗3×5 min。④抗原修復：置0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中用煮沸（95℃，15～20 min），自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗3×5 min。⑤正常羊血清工作液封閉，37℃10 min，傾去勿洗。⑥滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗3×5 min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照）；滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3×5 min。⑦滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37℃孵育 30 min，PBS 沖洗 3×5 min。⑧DAB/H2O2反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木精復染，常規脫水，透明，干燥，封片[4-5]。

1.4 結果判定

以武漢博士德生物科技有限公司和福州邁新生物科技有限公司提供的陽性切片為標準，在高倍光鏡下HIF-1α以細胞核或核漿內有棕黃色顆粒或被染色成棕黃色為陽性判定標準[6]。高倍鏡下（400）每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數150個細胞，共計750個，計算陽性細胞率，≤15%為陰性，＞15%為陽性。VEGF以細胞核或核漿內呈棕黃色為陽性細胞，＞10%為陽性，≤10%為陰性。MVD：低倍光鏡下選取血管分布最為密集的區域，400倍光鏡視野下隨機計數5個視野，CD34呈棕黃色為陽性，計數5個視野中的血管數的平均值構成MVD，要排除有炎癥、肉芽或壞死的血管[7]。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Pearson相關性分析研究各指標間的關系；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組臨床病理特征的對比

通過數據分析，在淋巴結轉移方面，觀察組的轉移率為65.8%（52/79），對照組的轉移率為35.8%（34/95），兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。在年齡、月經情況和雌、孕激素受體狀況方面差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。見表 1。

2.2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的表達及MVD計數

通過視鏡的觀察，HIF-1α的表達主要體現在浸潤腫瘤細胞的細胞核，觀察組陽性表達率高于對照組，差異有高度統計學意義（P＜0.01）；觀察組VEGF的陽性表達及MVD計數均高于對照組，差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表1 兩組患者臨床病理特征分析

表2 HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的表達及MVD計數

2.3 乳腺癌組織中HIF-1α的表達及其與 VEGF、微血管密度MVD的關系

觀察組HIF-1α陽性表達的71例組織中，65例VEGF陽性表達；HIF-1α陰性表達的8例組織中，6例VEGF陽性表達，差異有高度統計學意義（P＜0.01）。對照組HIF-1α陽性表達的69例組織中，56例VEGF陽性表達；HIF-1α陰性表達的26例組織中，21例VEGF陽性表達，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。觀察組組織中HIF-1α陽性者的MVD計數明顯多于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4。Pearson相關性分析發現，HIF-1α與VEGF及MVD均呈正相關（r=0.695，P ＜ 0.01；r=0.680，P ＜ 0.05）。

表3 乳腺癌組織中HIF-1α的表達與VEGF的相關性[n（%）]

表4 兩組患者不同HIF-1α表達情況MVD計數比較（）

表4 兩組患者不同HIF-1α表達情況MVD計數比較（）

注：HIF-1α：缺氧誘導因子-1α；MVD：微血管密度

組別 例數 HIF-1α陽性HIF-1α陰性 t值 P值觀察組對照組79 95 121.2±31.8 111.4±31.6 102.5±33.2 103.5±27.3 2.204 1.202 0.030 0.232

3 討論

既往的研究表明，合并糖尿病的乳腺癌患者的乳腺癌的分化程度比較低，預后也比較差[8-10]。在本研究中，HIF-1α和VEGF的陽性表達主要存在于乳腺癌細胞的細胞核內或是細胞核漿內，在浸潤癌細胞邊緣的表達相對較弱，這可以作為乳腺癌早期浸潤階段的生物學指標，提示不良的預后[11]。

血管的成長在各種組織的修復或惡化，炎癥和腫瘤的加重或增生、轉移過程中都有比較重要的作用[12-14]。特別是合并糖尿病、高血壓等并發癥的腫瘤患者的癌變組織需要通過新生的微血管來補充必要的養分來維持正常的生理代謝，為進一步的細胞增殖和轉移提供動力。在國內外已經有大量的研究表明，HIF-1α和VEGF是腫瘤誘導產生新血管的主要細胞因子，且HIF-1α的陽性表達是通過VEGF的陽性表達來實現的，可見VEGF在腫瘤新血管生成方面的作用比較強[15-17]。HIF-1α是在缺氧條件下存在于人體內的一種異源二聚體，既是氧調節亞基也是一種活性基，它可以和VEGF的結合位點相結合，促進癌變組織的新血管形成，維持癌細胞的正常代謝功能并能促進癌細胞的增殖和轉移[18-20]。在本研究中，通過數據的對比分析發現，合并2型糖尿病的乳腺癌患者HIF-1α的陽性表達率為89.9%（71/79），對照組患者為 72.6%（69/95）。這就表明，影響合并2型糖尿病的乳腺癌患者預后的重要因子就是HIF-1α。與此同時，本研究也檢測了兩組患者乳腺癌組織中MVD數量，結果顯示觀察組的MVD數量明顯高于對照組。這些都表明合并2型糖尿病的乳腺癌患者預后較差，與HIF-1α和VEGF的表達和MVD數量有直接的關系。本研究通過Pearson相關分析顯示，HIF-1α和 VEGF呈正相關（r=0.695，P ＜ 0.01），與 MVD 也呈正相關（r=0.680，P ＜ 0.05）。

綜上所述，通過研究合并2型糖尿病的乳腺癌組織中HIF-1α的表達及其與VEGF、MVD的關系，發現合并2型糖尿病可能會影響乳腺癌患者的病情甚至造成癌變組織的增生和轉移，使預后變差。這也為糖尿病與乳腺癌之間的關系提供了有力的依據。

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