AQP4及AQP4 mRNA在重型腦損傷中腦脊液中的表達及意義

譙明 彭艷 楊漢兵 雷振富 王俊英 彭雪剛 文剛

AQP4及AQP4 mRNA在重型腦損傷中腦脊液中的表達及意義

譙明 彭艷 楊漢兵 雷振富 王俊英 彭雪剛 文剛

目的 觀察重型腦損傷后腦脊液中水通道蛋白4（AQP4）及AQP4 mRNA的表達變化及意義。方法 選取重型顱腦損傷患者51例，對每例患者第0、3、7天腦脊液進行AQP4 ELISA（酶聯反應吸附實驗）含量測定，RT-PCR（實時定量聚合酶鏈式反應）測定AQP4 mRNA表達。結果 第0、3、7天腦脊液中均可檢測AQP4及AQP4 mRNA。第3天較第0天升高（P＜0.05），第7天較第3天降低（P＜0.05），第7天與第0天比較，差異無統計學意義。AQP4與AQP4mRNA相關（r=0.867）。結論 重型腦損傷后患者腦脊液AQP4的表達隨著病程變化，推測AQP4可能參與了腦損傷的病理過程，與病情的轉歸相關。

重型腦損傷；水通道蛋白4

水通道蛋白（aquaporins）有一個六跨膜α-螺旋結構域和共有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序，它構成了孔的一部分，在動植物及微生物細胞中廣泛分部的細胞膜轉運蛋白，與水通透性相關。1988年，Agre在分離紅細胞Rh蛋白時首先發現一種具有選擇性水通透的功能，分子量為28kD的蛋白，隨后被命名為AQP1[1]，至今在哺乳動物中共發現13種水通道蛋白家族。其中在腦內發現6種水通道蛋白，其中AQP4是腦內最重要、分布最廣的水通道蛋白，證明參與調控腦組織中水的沿滲透梯度由低滲向高滲移動[2]，與腦損傷后腦水腫的發生密切相關[3]。但現有研究均著重于動物實驗，對人體的直接研究較少。本研究觀察重型腦損傷后腦脊液中AQP4及AQP4 mRNA的表達變化及意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月～2014年12月四川省仁壽縣人民醫院重癥醫學科收治的重型顱腦損傷患者51例，GCS（格拉斯哥昏迷指數）評分4～8分，年齡23～73歲，平均（45±15）歲，其中男28例，女23例，其中4例患者于3d內死亡。受傷至手術時間0.5～3h。每例均行3次APECHEⅡ（急性生理與慢性健康評分）評分，均在10～25分，并行頭顱CT掃描確定顱內不同區域腦損傷。

1.2 主要儀器 酶標儀：Ganthos 2010型。低速離心機：北京白楊醫療公司BY-160C型。PCR機：中山大學達安基因Da-7600型。低溫冰箱：海爾公司醫用低溫保存箱DW-40LS08型。

1.3 主要試劑 人AQP4酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，廈門慧嘉生物科技有限公司。引物、內參及熒光PCR（聚合酶鏈式反應）體系由大連TaKaRa公司設計和合成。

1.4 實驗方法 收集每例患者第0、3、7天腦脊液并進行

AQP4及AQP4 mRNA含量測定：

（1）術后第0、3、7天抽取腦脊液，并3000r/min離心后取上清液置予凍存管于-20℃冰箱保存。

（2）待標本收集完成后，一次性在本院檢驗科免疫室行

ELISA檢測AQP4蛋白含量，嚴格按照試劑盒說明書進行實驗操作，每個樣本做3個復孔。

（3）RT-PCR（實時定量聚合酶鏈式反應）測定AQP4 mRNA的表達。

①先提取的DNA經逆轉錄成cDNA放-20℃冰箱保存。

②標本收集完全后行熒光定量PCR反應(SYBR Green I嵌合熒光法)測AQP4 mRNA的表達。按如下步驟進行。

1）由TaKaRa公司設計和合成人AQP4引物及內參照β-actin引物序列：

AQP4：上游5,-CGCGACTCCCAGCACATGAGAGC TGCACTCTGGCTGGGATAA-3,下游5,-GTCCTAAGC TTGTGAAAAATAAACATTTTGGATAAC-3。PCR產物：6216 bp。

β-actin：上游5,-CATCCGTATAGCGTCGTCAAGAC CTCTATGCCAAC-3,；下游5,-ATGGAGCCTAGCCTGCC GCGAACCGATCCACA-3。PCR產物：620 bp。

2）以CDNA 3L，總15L規格給予逆轉錄成mRNA，其中予1個循環95℃3分鐘預變性；40個循環95℃10秒變性，63.1℃30秒退火；再予80個循環55℃10秒融解。由RT-PCR機自動得出Ct值。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料用“x±s”表示，兩樣本均數比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

每例樣本反應結束后由計算機自動計算并讀出定量結果Ct值(threshold cycle)。采用Ct值。2-△△Ct法(△Ct＝Ctβ-actin－CtMuc5ac)進行相對定量。從以上腦脊液AQP4和β-actin擴增曲線圖和融解曲線圖可以看出(各標本均有擴增，且擴增效率高。各標本融解曲線無二聚體及非特異擴增峰，肺組織各峰值基本一致，說明引物設計合理，特異性高。見圖1～圖4。

圖1 β-actin擴增曲線圖

圖2 β-actin融解曲線圖

圖3 腦脊液AQP4擴增曲線圖

圖4 腦脊液AQP4融解曲線圖

腦脊液中AQP4蛋白及mRNA表達從第0天開始就升高，在第3天到高峰，第7天下降至正常水平。腦脊液中AQP4蛋白及mRNA表達第3天比第0天明顯增高，而第7天與第0天差異無統計學意義。第7天比第3天差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 腦脊液中AQP4蛋白表達（x±s）

3 討論

腦水腫是引起顱內高壓并腦疝的危險因素。研究表明，APQ4在顱內鉀的穩態中有重要的作用，并可激活小膠質細胞，參與血腦屏障（BBB）的破壞和釋放血管性水腫的趨化因子和細胞因子，由此AQP4的作用是水腫的形成和BBB破壞[4]。在腦出血大鼠模型中AQP4及AQP4 mRNA高表達[5]。在動物實驗中，缺少AQP4的小鼠腦組織可增加25%的體積[6]。

目前臨床上常用甘露醇及呋塞米進行脫水利尿降顱內壓，研究表明小鼠腦損傷模型中，注射甘露醇組的腦水腫程度及AQP4 表達都不同程度地降低[7]，但在本臨床觀察中，所有的腦出血組患者均給予甘露醇或/和呋塞米，但是AQP4的蛋白含量均不受此影響，持續增高，直到第7天。由此說明常規的脫水劑的應用并不能減輕腦組織水腫，僅能通過減少細胞外的水分來緩解顱內壓的增高，減輕顱內壓的效果并不理想，并均可引起明顯的水電解質紊亂，而引起相應的并發癥，增加患者的治療時間及后遺癥發生。

由此，AQP4蛋白的表達上調與腦水腫的發生、發展密切相關。目前已經在動物實驗中證實腦水腫給予抑制或拮抗AQP4蛋白的產生、表達可緩解腦水腫的表達[8-10]。另外，AQP4蛋白表達的高低與腦水腫的輕重程度密切聯系[11]。

本研究結果表明腦水腫從創傷性腦損傷發生開始，第3天到高峰，持續到第7天，若有專門拮抗AQP4通道藥物給予關閉水通道，減少自由水進入腦組織細胞內，可有效緩解腦水腫，有利于神經組織恢復和避免進一步損傷加重。未來可通過監測AQP4或AQP4 mRNA的水平來臨床評估腦水腫的病情及預后。

但本研究樣本量較少，具體的AQP4調控機制不明，對AQP-4的表達和調控的相關信號轉導通路的深入研究,可以在將來更好地調控AQP4的水平來控制腦水腫的發生、發展，并對藥物研制、臨床診斷提供新的思維更進一步的研究明確。

[1] Agre P,Bonhivers M,Borgnia MJ.The aquaporins,blueprints for cellular plumbing systems[J].J Biol Chem,1998,273(24):14659-14562.

[2] Tang Y,Wu P,Su J,et al.Effects of Aquaporin-4 on edema formation following intracerebral hemorrhage[J].Exp Neurol,2010,223(2):485-495.

[3] Graber DJ,Levy M,Kerr D,et al.Neuromyelitis optica pathogenesis and aquaporin 4[J].J Neuroinflammationm,2008,29(5):22.

[4] Fukuda AM,Badaut J.Aquaporin 4:a player in cerebral edema and neuroinflammation[J].J Neuroinflammation,2012,9:279.

[5] Ren Z,Iliff JJ,Yang L,et al.'Hit & Run' model of closed-skull traumatic brain injury(TBI)reveals complex patterns of post-traumatic AQP4 dysregulation[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33(6):834-845. [6] Yao X,Hrabetová S,Nicholson C,et al.Aquaporin-4-deficient mice have increased extracellular space without tortuosity change[J].J Neurosci,2008,28(21):5460-5464.

[7] 翁曉建,李守緘,唐霍全.甘露醇對重型顱腦損傷后腦組織含水量及AQP4 表達的變化[J].中國現代醫生，2009,47：32-33.

[8] Ding Z,Zhang J,Xu J,et al.Propofol administration modulates AQP-4 expression and brain edema after traumatic brain injury[J].Cell Biochem Biophy，2013，67(2):615-622.

[9] Chen GS,Huang KF,Huang CC,et al.Thaliporphine derivative improves acute lung injury after traumatic brain injury[J].Biomed Res Int,2015,2015:729831.

[10] Tang G,Liu Y,Zhang Z,et al.Mesenchymal stem cells maintain bloodbrain barrier integrity by inhibiting aquaporin-4 upregulation after cerebral ischemia[J].Stem Cells,2014,32(12):3150-3162.

[11] Neal CJ,Lee EY,Gyorgy A,et al.Effect of penetrating brain injury on aquaporin-4 expression using a rat model[J].J Neurotrau ma,2007,24(10):1609-1617.

Objective To observe the change of aquaporin (AQP)4 and AQP4 mRNA level in the cerebrospinal fluid of patients with severe brain injury and its clinical significance. Methods There are 51 severe traumatic brain injury patients. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) was used to determine cerebrospinal fluid AQP4 protein expression after 0,3,7 days，and RT-PCR (reverse transcription PCR) was used to determine AQP4 mRNA expression. Results AQP4 protein or mRNA expressed within the 0,3,7 days.The level of AQP4 or AQP4 mRNA increased 3 days after operation (P ＜0.05),and then statistically decreased 7 days after operation (P ＜0.05). But the 7 days had no statistically difference compared with 0 day after operation. Conclusion After Brain injury, AQP4 expression changes after brain injury is closely related with the formation of cerebral edema, AQP4 in the damage brain edema formation plays an important role.

Aevere brain injury; Aquaporin4

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.008

四川 620500 眉山市第二人民醫院（仁壽縣人民醫院）重癥醫學科 （譙明 彭艷 王俊英 彭雪剛 文剛） 眉山市第二人民醫院（仁壽縣人民醫院）神經外科 （楊漢兵） 眉山市第二人民醫院（仁壽縣人民醫院）檢驗科 （雷振富）

譙明 E-mail：qiaosong1980@163.com