纖維乙醇發酵殘渣中酶解木質素的提取與表征

潘奇，陳介南，張新民，詹鵬，張林

（1 中南林業科技大學國家林業局生物乙醇研究中心，湖南 長沙 410004；2 中南林業科技大學材料科學與工程學院，湖南 長沙 410004）

生物乙醇是一種燃燒熱值大、CO2排放量低的可再生燃料，與汽油或柴油以一定比例混合使用，不僅節約了不可再生能源，而且改善了燃燒過程，降低了有害物質的生產和排放，對生物乙醇的研究正日益受到廣泛關注[1]。利用木質纖維這種豐富廉價的“非糧”原料酶解發酵生產乙醇是解決能源匱乏的重要途徑，被稱為“第二代”生物乙醇，但是由于木質纖維結構復雜，酶解發酵技術仍需不斷完善，而且生產成本較高等問題，導致木質纖維生產生物乙醇一直沒有實現商業化生產。研究表明，發酵殘渣中除含有未酶解的纖維素、半纖維素和其他雜質外，還含有大量的木質素[2]，木質素化學活性較高，對其進行化學改性后的產品，已經廣泛應用于膠黏劑[3-5]、表面活性劑[6-7]、減水劑[8-9]等工業領域，在農業方面的應用潛力也十分廣闊，如復合緩釋肥料、農藥緩釋劑等在農業中的用量也很大。木質纖維酶解發酵生產生物乙醇過程中的殘渣通常被直接焚燒充當燃料，不僅經濟效益不高，而且對環境造成了一定的污染，對這些木質素進行回收利用將提高木質纖維轉化生物乙醇工業的經濟效益，對促進纖維乙醇工業的發展有重大意義。

木質素的分離方法主要有酸法、堿法、有機溶劑法，不同的分離方法分離的木質素結構有所差異。酸法是利用一定濃度的酸性溶液降解纖維素和半纖維素，從而分離得到酸不溶木質素，酸可以是有機酸或者無機酸，Klason 法是常用的測定與分離木質素的方法；堿法提取木質素的原理是木質素含有大量酚羥基，呈弱酸性，不溶于水，在堿溶液中形成木質素復合物而溶解，用酸作為沉淀絮凝劑，析出木質素，從而分離出木質素[10]；有機溶劑法是利用有機溶劑溶解木質素，經過沉淀，回收溶劑，分離得到木質素，不同有機溶劑分離得到的木質素結構有所差異[11-13]。

本工作采用一般堿法對發酵殘渣中的酶解木質素進行分離，研究了堿濃度、料液比、反應溫度、反應時間各因素對木質素提取效果的影響，通過正交試驗優化了提取條件，并對提取出的木質素結構進行表征，以期為酶解木質素進一步改性應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

楊木纖維乙醇發酵殘渣由國家林業局生物乙醇研究中心提供，其他試劑均為市售分析純。FZ102型微型植物粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；Eppendorf AG 22331 型高速離心機，德國艾本德公司；JA2003 電子天平，上海恒平科學儀器有限公司；UV-2450 型紫外可見光分光光度計，島津公司；FT-IR-8400s 型紅外光譜儀，島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

蠟、脂肪、樹脂、色素等物質容易與木質素形成縮合物，從而被一起分離出來。甲苯具有溶解樹脂、蠟、脂肪等的能力，乙醇又能溶出樹脂、單寧酸、色素、部分碳水化合物和微量的木質素，所以用苯醇混合物對原料進行抽提，將這些雜質除 去[14]。

將楊木纖維乙醇發酵殘渣于烘箱中60℃干燥，粉碎，過60 目篩。采用甲苯與乙醇（V∶V=2∶1）混合溶劑對粉碎的殘渣進行索氏抽提6h，回收甲苯- 乙醇溶劑，將抽提后的殘渣在60℃烘箱中烘干，得本實驗所用的原料，備用。

1.2.2 楊木纖維乙醇發酵殘渣中木質素含量的測定

采用72%硫酸法[15]測定楊木纖維乙醇發酵殘渣中木質素含量，稱量預處理樣品1.0000g，移入100mL 燒杯中，加入約20℃的質量分數 72% 硫酸 15mL，充分攪拌之后，在20℃ 下放置4h，將其移入1000mL 的圓底燒瓶中，以 560mL 蒸餾水洗滌后移入燒瓶中，加上回流冷凝管，煮沸4h，生成的不溶性殘渣用已恒重的玻璃漏斗抽濾，以熱水洗凈，105℃下干燥至恒重，稱量，計算產率，平行測 3 次，取平均值即為克拉森木質素的質量分數。

將1.0000g 預處理樣品放在坩堝中，于560℃的馬弗爐中灼燒至恒重，計算灰分的質量分數，平行測 3 次，再按下式計算木質素的總質量分數。

樣品中木質素質量分數= 克拉森木質素的質量分數－樣品總灰分質量分數

本研究殘渣中木質素的質量分數為39.78%。

1.2.3 木質素的提取

稱取5.0g 預處理的原料，加入一定濃度的NaOH 溶液，在某水浴溫度下恒溫浸泡提取一段時間，過濾，濾渣可以繼續回收作為生產楊木纖維乙醇的原料，濾液用鹽酸溶液調節pH 值至1.5，析出沉淀，在常溫下靜置隔夜，有明顯分層，去除上層清液，離心分離，沉淀先用pH=2 的鹽酸溶液洗滌離心，再用蒸餾水洗滌離心，沉淀于60℃烘箱中烘干，即得到酶解木質素。

1.2.4 木質素分離的單因素試驗

分別以不同濃度的NaOH（10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L），料液比[原料質量(g)∶堿溶液體積(mL)，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50]，反應溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃），反應時間（1h、1.5h、2h、2.5h、3h）為單因素，考察各因素對酶解木質素得率的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，采用 L9(34)正交試驗，進一步分析堿濃度、料液比、反應溫度以及反應時間對木質素得率的影響，優化木質素提取工藝。

1.2.6 木質素表征

紫外光譜測定：取少量干燥的本實驗所提取的酶解木質素樣品，溶于乙醇中，并以乙醇為空白，用紫外分光光度計測其在200～400nm 內的吸收 光譜。

紅外光譜測定：取少量干燥的本實驗所提取的木質素樣品，磨成粉末，再與溴化鉀粉末混合均勻，壓成薄片，利用紅外光譜儀測定其紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 NaOH 濃度對木質素提取得率的影響

在料液比1∶30、反應溫度50℃、反應時間2h條件下，考察不同NaOH 濃度對酶解木質素提取率的影響，結果如圖1 所示。

如圖1 所示，當堿濃度小于40g/L 時，酶解木質素的得率隨著堿濃度的增大而升高，當濃度為40g/L 時酶解木質素得率最大，繼續增大堿濃度，得率反而下降，這說明，酶解木質素在一定堿濃度溶液中，有很好的溶解性，濃度為40g/L 時，酶解木質素提取效果達到最佳，繼續增大堿濃度，可能對酶解木質素基鹽在堿溶液中的溶解造成一定阻礙，所以當堿濃度大于40g/L 時，酶解木質素的得率呈略微下降的趨勢，因此，選取合適的堿濃度水平30g/L、40g/L、50g/L 進行正交試驗。

圖1 堿濃度對木質素得率的影響

圖2 料液比對木質素得率的影響

2.1.2 料液比對木質素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、反應溫度50℃、反應時間2h條件下，考察不同料液比對酶解木質素提取率的影響，結果如圖2 所示。

如圖2 所示，當料液比大于1∶30 時，酶解木質素的得率隨著料液比的減小而增大，料液比為1∶30g/mL 時，得率達到最大，隨著料液比的繼續減小，酶解木質素的得率有所下降，適當的堿溶液體積對酶解木質素的提取有很好的促進作用，因此，選取合適的料液比水平 1∶20g/mL、1∶30g/mL、1∶40g/mL 進行正交試驗。

2.1.3 反應溫度對木質素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、料液比1∶30、反應時間2h條件下，考察不同反應溫度對酶解木質素提取率的影響，結果如圖3 所示。

如圖3 所示，當反應溫度在30～60℃范圍內時，酶解木質素的得率隨著溫度的升高而增大，當溫度達到60℃，酶解木質素的得率最大，繼續升高溫度，酶解木質素的得率反而減小，這可能是反應溫度在30～60℃范圍內時，隨著反應溫度的升高，原料中的酶解木質素與其他物質分離，并形成了溶解性較好的木質素復合物，在酸性環境中還原出了酶解木質素，得到了較好的提取效果，反應溫度大于60℃時，可能對木質素結構造成了一定影響，不能很好的溶解于堿溶液中，從而使得酶解木質素的得率減小，因此，選取合適的反應溫度水平50℃、60℃、70℃進行正交試驗。

圖3 反應溫度對木質素得率的影響

2.1.4 反應時間對木質素提取得率的影響

在堿濃度40g/L、料液比1∶30g/mL、反應溫度60℃條件下，考察不同反應時間對酶解木質素提取率的影響，結果如圖4 所示。

圖4 反應時間對木質素得率的影響

如圖4所示，當反應時間少于2h時，酶解木質素的得率隨著反應時間的延長而增大，當反應時間達到2h 時，得率最大，繼續延長反應時間對得率的影響不大，且有略微下降。可能是由于反應時間為2h 時，酶解木質素在堿溶液中的溶解已經達到飽和，延長反應時間有部分酶解木質素因為聚積而析出，導致得率略微下降，所以選取合適的反應時間水平1.5h、2h、2.5h 進行正交試驗。

2.2 酶解木質素提取的正交試驗結果

根據單因素試驗的研究結果，將堿濃度、料液比、反應溫度和反應時間作為考察因素，按照 L9(34)正交試驗對酶解木質素提取工藝進行優化，結果見表1 和表2。

由表2 可知，各因素對酶解木質素得率的影響最大的是堿濃度，其次是反應溫度、料液比，最后是反應時間。最佳的工藝條件組合是NaOH 濃度40g/L、反應溫度60℃、料液比1∶30g/mL、反應時間2.5h。

表1 因素水平表

表2 正交試驗方案設計結果

對正交試驗所得最佳提取工藝進行驗證實驗，3 次平行重復實驗得到酶解木質素的得率分別為37.5%、37.45%、37.08%。通過驗證實驗可知，在最佳工藝條件下，酶解木質素的平均得率為37.34%，優于表2 中任一試驗。

2.3 紫外光譜分析

在200～400nm 范圍內掃描，測得本實驗所提取的酶解木質素紫外光譜如圖5 所示，在230nm 附近有較強的吸收帶，說明具有較大的不飽和度，在280nm 附近出現寬肩峰是苯環的特征吸收峰，表明所測樣品為芳香族化合物，這與紅松木質素、云杉木質素、棉稈木質素的紫外光譜圖接近[15-17]。

圖5 酶解木質素的紫外吸收光譜

2.4 紅外光譜分析

本實驗所提取酶解木質素的紅外光譜圖如圖6所示。與光譜圖對應的各吸收峰歸屬分析見表3[18-20]。由表3 分析可知，發酵殘渣中的酶解木質素結構單元主要是紫丁香基，其中側鏈還有各種功能基團，如羥基、甲基、羰基等，酶解木質素是一種具有一定化學活性的物質，能夠對其進行化學改性，應用到各相關領域中。該紅外光譜與油茶殼[21]木質素和酶解玉米秸稈木質素[22]的紅外光譜基本一致。

3 結 論

圖6 酶解木質素的紅外光譜圖

表3 酶解木質素的紅外光譜吸收表

（1）本研究通過單因素試驗和正交試驗對一 般堿法提取發酵殘渣中酶解木質素的提取工藝進行優化，確定了最佳的提取工藝為 NaOH 濃度 40g/L、料液比1∶30、反應溫度60℃、反應時間2.5h。在最佳工藝條件下，酶解木質素得率達到37.34%，對正交試驗進行極差分析可知，堿濃度對酶解木質素的提取影響顯著，選擇合適的堿濃度至關重要。

（2）提取得到的酶解木質素為紫黑色塊狀固體，研磨得到棕褐色粉末，不溶于水，通過紫外光譜和紅外光譜分析，驗證了酶解木質素的芳香族結構，以紫丁香基木質素為主，而且具有羥基、羰基、甲氧基等活性基團，為其進一步改性應用提供理論基礎。

（3）采用一般堿法提取發酵殘渣中的酶解木 質素，具有反應條件溫和、操作簡單、提取率較高等優點。提取的酶解木質素具有良好的化學活性，可以對其進行改性，得到高附加值的產品，應用到工農業各領域。由于發酵殘渣中木質素的提取，殘渣中木質纖維結構更為松散，纖維素酶更易與纖維素和半纖維素接觸，可以對其進行再次酶解發酵制取生物乙醇。這些都能降低木質纖維乙醇的生產成本，提高經濟效益，促進木質纖維轉化生物乙醇工業的發展。

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