超聲萃取法檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫

孫高英，胡禮淵，廖和菁，劉瑞芳，竇曉明，候方妮（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

超聲萃取法檢測水產品中孔雀石綠、結晶紫

孫高英，胡禮淵，廖和菁，劉瑞芳，竇曉明，候方妮
（廣西東興出入境檢驗檢疫局，廣西東興538100）

摘要：探索了使用超聲萃取水產品中孔雀石綠、結晶紫的高效液相熒光檢測方法，通過試驗獲得最佳方案。結果表明，超聲提取時間為15 min。本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范圍內具有很好的線性，相關系數R為0.999 9，最低檢出限為0.5 μg/kg。采用不同的樣品進行驗證，回收率在80%～110%之間，相對標準偏差（RSD）為1%～3%。

關鍵詞：孔雀石綠；結晶紫；超聲波萃取

孔雀石綠（malachite green，MG）和結晶紫（crystal violet，CV）在水產養殖過程中，常作為抗真菌感染和殺滅寄生蟲，用于防治各種魚病[1-3]。該類物質在魚體內代謝為隱色孔雀石綠（LMG）和隱色結晶紫（LCV）（見圖1），具有高毒素、高殘留和致癌、致畸、致突變作用[4-7]，且孔雀石綠在魚體及其他生物體內會經過代謝轉化成無色孔雀石綠，其危害更大，殘留時間也更長，現在已被被歐美國家、日本列為不得檢出的禁用藥物[8-9]，中國于2002年5月將孔雀石綠列為禁用藥[10]。

本方法以國標GB/T20361-2006《水產品孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》為基礎，結合實際，加以適當優化，建立了高效液相色譜的快速篩選方法，同時探討測定過程中應注意的一些問題。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器設備

1.1.1試劑

乙腈、甲醇、二氯甲烷為色譜純；冰乙酸、鹽酸羥胺、對甲苯磺酸、氨水、乙酸銨為分析純；孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結晶紫、隱色結晶紫：純度≥98%。提取液：鹽酸羥胺3 g，對甲苯磺酸0.24 g溶于100 mL水中；硼氫化鉀（0.1 mol/L）現配現用；陽離子交換柱：PRS柱，500 mg、3 mL；乙酸銨緩沖溶液：稱取9.64 g無水乙酸銨溶解于1 000 mL水中，用冰乙酸調pH到4.5；乙酸銨緩沖溶液（0.1 mol/L）：稱取0.77 g無水乙酸銨溶解于100 mL水中，用氨水調pH到10；洗脫液：乙酸銨溶液：乙腈：1∶1（體積比），臨用前配制；標準儲備溶液：準確稱取孔雀石綠標準品，用乙腈配制成100 g/mL的標準貯備液；標準中間溶液：吸取孔雀石綠和無色孔雀石綠的標準儲備溶液，用乙腈稀釋成1 μg/mL，-18℃避光保存（因孔雀石綠結晶紫在常溫及冷藏下均可降解[11]）。

1.1.2儀器設備

1200型高效液相色譜儀（配有熒光檢測器、固相萃取裝置）、旋轉N-1000蒸發儀：美國Agilent公司；高速離心機：時代北利DT5-1（原LD4-2A）。

1.2測定方法

1.2.1提取

稱取處理好的樣品約5.00g置于50mL離心管中，加入10mL的乙腈，加入酸性氧化鋁5g，震蕩2min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心10 min，上清液轉移至125 mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入二甘醇2 mL，3 mL硼氰化鉀具塞，劇烈振搖2 min。

在50 mL離心管中繼續加入1.5 mL的鹽酸羥胺溶液、2.5 mL對-甲苯磺酸溶液、5.0 mL乙酸銨緩沖溶液，振蕩2 min，再加入10 mL的乙腈，繼續振蕩2 min，超聲提取15 min，4 000 r/min離心10 min，上清液并入125 mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入20 mL二氯甲烷，具塞劇烈振搖2 min，靜置分層，將下層溶液轉移至250 mL茄形瓶中，繼續在分液漏斗中加入5mL乙腈，10mL二氯甲烷，振搖2min，將全部溶液轉移至50mL離心管，4000r/min離心10 min，將下層溶液并入250 mL茄形瓶中，45℃旋轉蒸發至近干，用3 mL乙腈溶解殘渣。

1.2.2凈化

將PRS柱子接到固相萃取裝置上，上端接酸性氧化鋁柱，先用5 mL的乙腈分兩次活化柱子，轉移提取液到柱上，然后用2.5 mL乙腈洗滌茄形瓶兩次，依次過柱，棄去酸性氧化鋁柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情況下，加入3 mL等體積混合的乙腈和乙酸銨溶液，收集洗脫液，乙腈定容至3 mL，過0.45 μm濾膜，供液相色譜測定。

1.2.3色譜條件

色譜柱：ODS-C18、5μm、4.6mm×250mm；流動相：乙腈+乙酸銨（80+20）；流速：1.3mL/min；激發波長：265nm；發射波長：360 nm；進樣量：200 μL。

2　結果與分析

2.1超聲提取時間的比較

分別超聲5、10、15、20、25、30 min來提取水產品樣品中孔雀石綠和結晶紫，測回收率，結果見圖1、圖2。

圖1　不同萃取時間孔雀石綠的回收率比較Fig.1　Comparing different extraction time，the recovery rate of malachite green

圖2　不同萃取時間結晶紫的回收率比較Fig.2　Compare the different extraction time，the recovery rate of crystal violet

結果表明：水產品樣品中孔雀石綠和結晶紫的回收率在15 min最高，并且隨著時間的延長變化不大，因此選擇超聲提取15 min最為合適。

2.2超聲萃取與均質萃取步驟回收率的比較

通過測定超聲萃取與均質萃取兩個步驟的回收率情況，結果見表1。

表1　超聲萃取與均質萃取回收率的比較Table 1　Ultrasonic extraction was compared with the homogeneous extraction recovery rate

由表1可知，超聲萃取的回收率高于均質萃取，分析原因可能因為均質器上會有殘留從而導致回收率偏低，使用超聲節省了試驗步驟，提高了回收率，降低了污染的可能性。

2.3萃取3次與萃取2次的回收率的比較

國標方法在1.2.1中萃取了3次，前處理按照超聲提取后萃取2次與萃取3次進行比較，通過比較2種方法的回收率，結果見表2。

表2　萃取2次與萃取3次的回收率的比較Table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

續表2　萃取2次與萃取3次的回收率的比較Continue table 2　The recovery rate of extracting 2 times and 3 times of comparison

由表2可知，兩種處理步驟回收率差別不大，可以忽略不計，因此采用萃取2次可節省藥品及前處理步驟。

2.4本方法精密度試驗

取未檢出含孔雀石綠、結晶紫，定量添加孔雀石綠、結晶紫及其代謝物隱性孔雀石綠和隱性結晶紫標準品后再進行檢測，將檢測值除以實際添加值，計算回收率。具體操作如下：精密稱取空白魚肉樣品5.00 g，置于100 mL離心管中，按表3中的加標濃度分別準確加入一定量的混合標準溶液，充分混勻，制成不同濃度的加標樣品，按1.2測定方法中的提取、凈化和液相色譜條件進行試驗，每一濃度平行進行6次試驗，計算回收率及相對標準偏差，結果見表3。

表3　添加不同濃度的孔雀石綠與結晶紫的回收率及相對標準偏差Table 3　Adding different concentrations of malachite green and crystal violet recoveries and relative standard deviation

由表3可知，回收率在90%～101%之間，相對標準偏差在1.4%～2.5%之間。

2.5本方法線性范圍及檢出限

本方法在0.5 μg/mL～800 μg/mL范圍內具有很好的線性，相關系數R為0.999 9，最低檢出限0.5 μg/kg。

3　討論

本方法根據國標方法GB/T20361-2006《水產品孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》作了部分改進，減少了樣品前處理時所用步驟，從而減少了孔雀石綠、結晶紫在提取過程中的損耗，減少了試劑的使用，提高了回收率，一定程度上避免了二次污染。本方法有較大的測試線性范圍和良好的精密度準確度，可為各類水產品及其制品中孔雀石綠、結晶紫殘留的測定提供參考。

參考文獻：

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[3]Schnick R A.Malachite green:Review[J].Fish Cult,1988(50):190, 196

[4]Meyer F Jorgensen T A.Toxicological and other effects of malachite green on development of rainbow trout and rabbits[J].Trans Am Fish Soc,1983,112(6):818-824

[5]Femandes C,Lalitha V S,Ran V K.Enhancing effect ofmalachite green on development of hepatic pre·neoplastic lesions induced byN-nitrosodiethylamine in rats[J].Carcinogenesis,1991(12):839-845

[6]Rao K V K.Inhibition of DNA synthesis in primary rat hepatocyte cultures by malachite green:a new liver tamor promoter[J].Toxicology letters,1995,81(23):107-113

[7]Gouranchat C.Malachite green in fish culture(state of the art and perspectives)[R].Bibliographic studies.Vetefinaire ENVT Nantes France:Ecole Natl,2000:142

[8]孫滿義,楊賢慶,岑劍偉,等.水產品中孔雀石綠的研究進展[J].食品工業科技,2009,30(2):312-315

[9]彭貞,鄭玉琴.孔雀石綠與蛋白質相互作用的電化學行為的研究[J].化學試劑,2009,31(1):49-51

[10]中華人民共和國農業部.食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單[Z].中華人民共和國農業部第193號公告,2002

[11]穆迎春,邢麗紅,馬兵,等.不同貯藏條件下孔雀石綠加標樣品降解研究[J].中國農學通報,2012,28(2):83-89

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.044

收稿日期：2014-02-12

作者簡介：孫高英（1981—），女（漢），工程師，碩士，從事食品檢驗檢疫工作。

Determination of Malachite Green，Crystal Violet and Their Metabolites Residues in Aquatic Product by Ultrasound-assited Extraction

SUN Gao-ying，HU Li-yuan，LIAO He-jing，LIU Rui-fang，DOU Xiao-ming，HOU Fang-ni
（Guangxi Import and Export Inspection and Quarantine Bureau，Dongxing 538100，Guangxi，China）

Abstract：This study explores the use of ultrasound-assited extraction of aquatic products of malachite green，crystal violet and HPLC fluorescence detection method，through the test to obtain the best solutions.The results showed that the ultrasound-assited extraction time is 15 min.This method has a good linear l scope between 0.5 μg/mLand800μg/mL，correlationcoefficient was0.9999，thelimitofdetectionwas0.5 μg/kg.Using different sample verification，the recovery rate is between 80%-110%，relative standard deviation（RSD）is 1%-3%.

Key words：malachite green；crystal violet；ultrasound-assited extraction