響應(yīng)面法優(yōu)化固定化果膠酶制備黑莓汁工藝

丁愛鳳，黃卉卉，孫嘉文，謝惠惠（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

響應(yīng)面法優(yōu)化固定化果膠酶制備黑莓汁工藝

丁愛鳳，黃卉卉，孫嘉文，謝惠惠
（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

摘要：利用固定化果膠酶處理黑莓漿，可以提高黑莓的出汁率，降低生產(chǎn)成本，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Design-Expert軟件進(jìn)行影響因素響應(yīng)面分析，優(yōu)化固定化果膠酶制備黑莓汁的工藝條件。結(jié)果顯示，影響因素的影響大小順序?yàn)椋汗潭ɑz酶水解溫度＞固定化果膠酶水解時(shí)間＞固定化果膠酶使用質(zhì)量＞黑莓pH；響應(yīng)面分析試驗(yàn)得到黑莓出汁率回歸方程，方程達(dá)到極顯著水平（F=50.48；P<0.000 1），擬和很好（R2Pred=0.794 5；R2Adj= 0.965 3）；固定化果膠酶制備黑莓汁優(yōu)化工藝參數(shù)為：30 g黑莓漿使用固定化果膠酶為5 g、固定化果膠酶水解時(shí)間為1.0 h、固定化果膠酶水解溫度為52℃；利用優(yōu)化工藝，平均黑莓出汁率達(dá)到70.83%。固定化果膠酶重復(fù)使用13次，第13次黑莓出汁率為65.91%（對(duì)照組62.37%）。

關(guān)鍵詞：固定化果膠酶；出汁率；黑莓汁；響應(yīng)面分析

新鮮黑莓儲(chǔ)藏困難，貨架期短，很容易發(fā)生腐爛[1-3]。因此，將黑莓加工成各種食品，不僅可以降低因腐敗而造成的經(jīng)濟(jì)損失，還可提高黑莓的附加值[4-6]。黑莓制成果汁飲料時(shí)多數(shù)加工成澄清汁，也有加工成果茶、果肉飲料和混合飲料[4-6]。

黑莓成熟期間水溶性多糖醛酸苷從30%增加到65%，半纖維素也發(fā)生降解，使黑莓在破碎后成膠粘狀，直接榨汁困難，出汁率低，果汁渾濁不清，且大量的果膠物質(zhì)進(jìn)入原汁會(huì)造成澄清等后續(xù)工序的難度加大[4-8]。

固定化酶與游離酶相比，固定化酶穩(wěn)定性有較大提高，對(duì)溫度和pH的適應(yīng)范圍增大，對(duì)抑制劑和蛋白酶的敏感性降低；酶可以多次重復(fù)使用，也便于產(chǎn)品的分離和純化；實(shí)現(xiàn)批量或連續(xù)操作模型的可能，適于產(chǎn)業(yè)化、連續(xù)化、自動(dòng)化生產(chǎn)；可以降低生產(chǎn)成本。

目前，鮮見利用固定化果膠酶提高黑莓出汁率的報(bào)道。本研究采用固定化果膠酶處理黑莓漿，提高黑莓出汁率，為固定化果膠酶在黑莓汁生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅顏黑莓：南京市溧水區(qū)傅家邊；固定化果膠酶（256 U/g）：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)生物工程系。

1.2儀器與設(shè)備

SQ 2008型多功能食品加工機(jī)：上海帥佳電子科技有限公司；80-2型離心機(jī)：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；CHA-S型恒溫振蕩器：國(guó)華企業(yè)；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；YJ501型超級(jí)恒溫器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1黑莓漿的制備

選取新鮮、無害蟲、無霉?fàn)€的黑莓，清洗瀝干后去梗，用打漿機(jī)將黑莓打漿3次，每次10 s，得到黑莓漿。

1.3.2固定化果膠酶對(duì)黑莓出汁率的影響

稱取30 g黑莓漿，加入一定質(zhì)量的固定化果膠酶，在55℃下振蕩反應(yīng)一定時(shí)間后，取出固定化果膠酶，將處理后黑莓漿在3 600 r/min下離心16 min，測(cè)定沉淀的黑莓渣質(zhì)量，計(jì)算其出汁率。

式中：Y為出汁率，%；A為黑莓漿重，g；B為黑莓渣重，g。

1.3.2.1固定化果膠酶使用質(zhì)量對(duì)黑莓出汁率的影響

稱取黑莓漿，每份30 g，分別加入0、1、2、3、4、5 g固定化果膠酶，在55℃下振蕩水解1 h，然后按照1.3.2操作，設(shè)計(jì)平行試驗(yàn)。計(jì)算黑莓漿的出汁率（以未加果膠酶為對(duì)照組）。

1.3.2.2水解時(shí)間對(duì)黑莓出汁率的影響

稱取黑莓漿，每份30 g，加入最適宜質(zhì)量的固定化果膠酶，在55℃下分別振蕩水解0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，然后按照1.3.2操作，設(shè)計(jì)平行試驗(yàn)。計(jì)算黑莓漿的出汁率（以未加果膠酶為對(duì)照組）。

1.3.2.3水解溫度對(duì)黑莓出汁率的影響

稱取黑莓漿，每份30 g，加入一定量固定化果膠酶，分別在45、50、55、60、65℃振蕩水解1 h，然后按照1.3.2操作設(shè)計(jì)平行試驗(yàn)。計(jì)算黑莓漿的出汁率（以未加果膠酶為對(duì)照組）。

1.3.2.4黑莓漿pH對(duì)黑莓出汁率的影響

稱取黑莓漿，每份30 g，分別調(diào)pH為3.2、3.4、3.6、3.8和4.0，然后按照1.3.2操作。計(jì)算黑莓漿的出汁率（未調(diào)節(jié)pH的天然黑莓漿pH 3.48，加果膠酶，以其作為對(duì)照組）。

1.3.3響應(yīng)面優(yōu)化固定化酶水解工藝參數(shù)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以固定化果膠酶使用質(zhì)量（A）、固定化果膠酶水解時(shí)間（B）和固定化果膠酶水解溫度（C）為影響因子進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1　響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels in the response surface design

以黑莓出汁率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 6.0.5軟件對(duì)Box-Behnken中心組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，確定固定化果膠酶制備黑莓汁的工藝。

2　結(jié)果與分析

2.1固定化果膠酶使用質(zhì)量對(duì)黑莓出汁率的影響

固定化果膠酶使用質(zhì)量對(duì)黑莓出汁率的影響見圖1。

圖1　固定化果膠酶的使用質(zhì)量對(duì)黑莓出汁率的影響Fig.1 Effect of immobilized pectinase application amount on blackberry juice yield

由圖1可知，對(duì)照組的出汁率為62.10%，而試驗(yàn)組的出汁率都大于對(duì)照組。隨著固定化果膠酶的使用質(zhì)量的增加，黑莓出汁率也增加，在固定化果膠酶使用量4 g時(shí)，黑莓出汁率達(dá)到74.56%，這時(shí)固定化果膠酶與黑莓漿的質(zhì)量比為1∶7.5。當(dāng)固定化果膠酶使用質(zhì)量大于4 g以后，黑莓出汁率無明顯變化。

2.2固定化果膠酶水解時(shí)間對(duì)黑莓出汁率的影響

固定化果膠酶水解時(shí)間對(duì)黑莓出汁率的影響見圖2。

圖2　固定化果膠酶水解時(shí)間對(duì)黑莓出汁率的影響Fig.2　Effect of immobilized pectinase reaction time on blackberry juice yield

由圖2可知，固定化果膠酶對(duì)黑莓漿的處理時(shí)間小于1.0 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，黑莓出汁率明顯增加；在1.0 h時(shí)，黑莓出汁率達(dá)到72.80%，然后隨著時(shí)間的增加，黑莓出汁率基本不變，而對(duì)照組的出汁率為62.11%。

2.3固定化果膠酶水解溫度對(duì)黑莓出汁率的影響

固定化果膠酶水解溫度對(duì)黑莓出汁率的影響見圖3。

圖3　固定化果膠酶水解溫度對(duì)黑莓出汁率的影響Fig.3　Effect of immobilized pectinase reaction temperature on blackberry juice yield

由圖3可知，在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，對(duì)照組出汁率約為62.13%，而試驗(yàn)組的出汁率高于對(duì)照組。在40℃～55℃范圍內(nèi)，隨著果膠酶水解溫度提高，黑莓出汁率不斷提高，55℃水解時(shí)出汁率達(dá)到最高為72.86%。水解溫度大于55℃時(shí)，出汁率開始下降。

2.4黑莓漿pH對(duì)黑莓出汁率的影響

黑莓漿pH對(duì)黑莓出汁率的影響見圖4。

由圖4可知，試驗(yàn)組在試驗(yàn)pH范圍內(nèi)，出汁率最大為72.38%（pH 3.4），最小為72.19%（pH 4.0）。對(duì)照組（pH 3.48）固定化果膠酶水解天然黑莓漿的出汁率為72.32%。由此可見，在試驗(yàn)pH范圍內(nèi)，黑莓漿的酸度對(duì)固定化果膠酶水解能力影響很小。

圖4　黑莓漿pH對(duì)黑莓出汁率的影響Fig.4　Effect of blackberry juice pH on blackberry juice yield

2.5固定化果膠酶提高黑莓出汁率工藝參數(shù)的優(yōu)選

2.5.1響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用固定化果膠酶使用質(zhì)量、固定化果膠酶水解時(shí)間和固定化果膠酶水解溫度三個(gè)影響因子，利用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。共17個(gè)試驗(yàn)，包括12個(gè)析因試驗(yàn)和5個(gè)檢驗(yàn)誤差的零點(diǎn)試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Response surface design matrix and the experimental and the predicted values of the apple juice yield

2.5.2黑莓出汁率模型及可信度

利用軟件SAS程序?qū)Τ鲋蔬M(jìn)行回歸分析，經(jīng)過回歸擬和得到出汁率（Y）與3個(gè)因素二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y=72.736+0.691 25A+0.731 25B-0.141C-0.85675A2-2.35675B2-3.65925C2-0.2725AB+0.27AC+ 0.815BC。

模型方程表達(dá)了黑莓出汁率與所選3個(gè)因素之間的關(guān)系，方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值反映各因素對(duì)出汁率的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。模型可信度分析見表3。

表3　模型可信度分析Table 3　Model analysis of reliability

由表3可知，R2Pred為0.794 5，而R2Adj為0.965 3，因此該模型具有相當(dāng)高的擬合度。信噪比Rsn為21.761，遠(yuǎn)大于4.0，模型的可信度很高。

2.5.3黑莓出汁率模型顯著性分析

利用Design-expert分析軟件，對(duì)回歸方程模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見由表4。

表4　響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4　Analysis of variances for the developed quadratic regression model

由表4可知，模型具有高度的顯著性（F=50.48；P< 0.000 1）；相對(duì)于純誤差來說，失擬（F=0.051 0）不顯著。因此，該模型可以用來實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)。

若P值小于0.05表明影響因子有顯著影響；若P值大于0.1說明影響因子沒有顯著影響。由表4可知，固定化果膠酶使用質(zhì)量（P=0.008 2）、固定化果膠酶水解時(shí)間（P=0.006 2）、固定化果膠酶水解溫度（P= 0.000 1）和固定化果膠酶水解時(shí)間與固定化果膠酶水解溫度的交互作用（P=0.018 8）對(duì)黑莓出汁率有顯著影響。該模型中3個(gè)因素的影響順序?yàn)椋汗潭ɑz酶水解溫度＞固定化果膠酶水解時(shí)間＞固定化果膠酶使用質(zhì)量。

2.5.4響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程模型，導(dǎo)出響應(yīng)面曲面圖，詳見圖4～圖6，3組圖直觀地反映了各因素對(duì)黑莓出汁率的影響。

圖4　固定化果膠酶使用質(zhì)量和水解時(shí)間對(duì)出汁率影響Fig.4　Effect of quality and hydrolysis time of immobilized pectinase on juice yield

圖5　固定化果膠酶使用質(zhì)量和水解溫度對(duì)出汁率影響Fig.5　Effect of quality and hydrolysis temperature of immobilized pectinase on juice yield

圖6　固定化果膠酶水解溫度和水解時(shí)間對(duì)出汁率影響Fig.6　Effect of quality and hydrolysis temperature of and hydrolysis time of immobilized pectinase on juice yield

由圖4可知，在固定化果膠酶使用質(zhì)量一定時(shí)，酶水解時(shí)間在-1～+0.5水平范圍內(nèi)，隨著水解時(shí)間增加，黑莓出汁率快速增加，在+0.5水平時(shí)，出汁率達(dá)到最大；而水解時(shí)間在+0.5～+1水平范圍內(nèi)，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，黑莓出汁率開始緩慢下降。在水解時(shí)間一定時(shí)，固定化果膠酶使用質(zhì)量在-1～+0.5水平范圍內(nèi)，隨著酶使用質(zhì)量的增加，出汁率也隨之增加，在+0.5水平時(shí)，出汁率達(dá)最大；而酶使用質(zhì)量在+0.5～+1水平范圍內(nèi)，隨酶使用質(zhì)量增加，出汁率出現(xiàn)緩慢下降。

由圖5可知，在酶水解溫度一定時(shí)，固定化果膠酶使用質(zhì)量在-1～+0.5水平范圍內(nèi)，隨著使用質(zhì)量的增加，黑莓出汁率也增加，在+0.5水平時(shí)，出汁率達(dá)到最大；而酶使用質(zhì)量在+0.5～+1水平范圍內(nèi)，隨著酶使用質(zhì)量的增加，出汁率基本處于相同水平。在固定化果膠酶使用質(zhì)量一定時(shí)，酶水解溫度在-1～0水平范圍內(nèi)，隨著水解溫度的提高，黑莓出汁率隨之增加，在0水平時(shí)，出汁率達(dá)最大；水解溫度在0～+1水平范圍內(nèi)，隨水解時(shí)間延長(zhǎng)，黑莓出汁率快速下降。

由圖6可知，在酶水解時(shí)間一定時(shí)，酶水解溫度在-1～0水平范圍內(nèi)，隨著水解溫度提高，黑莓出汁率逐漸提高，在0水平時(shí)，出汁率達(dá)到最大；在酶解溫度0～+1水平范圍內(nèi)，隨著水解溫度的提高，出汁率逐漸下降。在酶水解溫度一定時(shí)，酶水解時(shí)間在-1～+0.5水平范圍內(nèi)，隨著水解時(shí)間增加，黑莓出汁率逐步增加，在+0.5水平附近，出汁率達(dá)最大；在水解時(shí)間+0.5～+1水平范圍內(nèi)，隨著水解時(shí)間增加，出汁率緩慢下降。

為了進(jìn)一步確定3個(gè)因素對(duì)出汁率的影響，對(duì)所得方程進(jìn)行逐步回歸，回歸模型存在穩(wěn)定點(diǎn)編碼值（+1.00，+0.07，-0.15），穩(wěn)定點(diǎn)的特征值表明為穩(wěn)定點(diǎn)的目標(biāo)點(diǎn)，即最佳工藝參數(shù)為：在30 g黑莓漿中固定化果膠酶使用質(zhì)量為5 g、固定化果膠酶水解時(shí)間為1.04 h、固定化果膠酶水解溫度為52.25℃，在此條件下，出汁率預(yù)測(cè)值為71.67%。為了便于實(shí)際操作，生產(chǎn)過程中確定30 g黑莓漿使用固定化果膠酶為5 g、固定化果膠酶水解時(shí)間為1.0 h、固定化果膠酶水解溫度為52℃。

2.6優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)和固定化果膠酶重復(fù)試驗(yàn)

按照修訂的優(yōu)化工藝參數(shù)，共進(jìn)行8樣本平行試驗(yàn)，平均黑莓出汁率達(dá)到70.83%，與預(yù)測(cè)得率71.67%有很好吻合度。

2.7固定化果膠酶重復(fù)試驗(yàn)

固定化果膠酶間斷重復(fù)使用13次，第13次時(shí)黑莓出汁率為65.91%，仍高于對(duì)照組62.37%。

3　結(jié)論

采用固定化果膠酶水解黑莓漿，經(jīng)過回歸擬和得到黑莓出汁率（Y）與固定化果膠酶使用質(zhì)量、水解時(shí)間和水解溫度等3個(gè)因素二次多項(xiàng)回歸方程模型：Y= 72.736+0.691 25A+0.731 25B-0.141C-0.856 75A2-2.356 75B2-3.659 25C2-0.272 5AB+0.27AC+0.815BC。

模型方程達(dá)到極顯著水平，擬和度高，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)可以對(duì)黑莓出汁率進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。

影響固定化果膠酶制備黑莓汁的因素順序?yàn)椋汗潭ɑz酶水解溫度＞固定化果膠酶水解時(shí)間＞固定化果膠酶使用質(zhì)量。而黑莓漿pH，在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)固定化果膠酶水解能力影響極小。

固定化果膠酶制備黑莓汁的優(yōu)化工藝為：30 g黑莓漿使用固定化果膠酶為5 g、固定化果膠酶水解時(shí)間為1.0 h、固定化果膠酶水解溫度為52℃。平均黑莓出汁率達(dá)到70.83%。

固定化果膠酶間斷重復(fù)使用，第13次時(shí)黑莓出汁率為65.91%，而對(duì)照組為62.37%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.029

收稿日期：2015-05-26

基金項(xiàng)目：江蘇省大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目(W_DCX12001)

作者簡(jiǎn)介：丁愛鳳（1972—），女（漢），講師，本科，研究方向：食品工程。

Process Optimization of Blackberry Juice Preparation on Immobilized Pectinase by Response Surface

DING Ai-feng，HUANG Hui-hui，SUN Jia-wen，XIE Hui-hui
（College of Food Science and Engineering，Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210003，Jiangsu，China）

Abstract：Blackberry pulp was hydrolyzed with the immobilized pectinases，which could improve the blackberry juice yield，reduce production cost and increase the economic efficiency of enterprises.The process condition of blackberry juice which produced in immobilized pectinases was optimized through the response surface analysis of influence factor by Design-Expert software on the basis of single factor experiment.The result indicated that the effect of the hydrolysis temperature of the immobilized pectinases was greater than that of the hydrolysis time of the immobilized pectinases，the amount of the immobilized pectinases and，the pH of blackberry pulp，and the effect of the pH of blackberry pulp was the minimum during four influence factors；the regression equation of blackberry juice rate was established in the response surface analysis of the effect factors，the equation reached the extremely significant level（F=50.48；P<0.000 1）and good agreement（R2Pred=0.794 5；R2Adj=0.965 3）；The optimization process parameters which the immobilized pectinases produced blackberry juice as follow：30 g blackberry pulp，5 g immobilized pectinases，the immobilized pectinases hydrolysis time for 1 hour，the immobilized pectinases hydrolysis temperature of 52℃，in which the average juice yield of blackberry was 70.83%.The immobilized pectinases was used for 13 times，blackberry juice yield was 65.91% at the thirteenth（control group 62.37%）.

Key words：immobilized pectinase；juice yield；blackberry juice；response surface analysis