酶解胡麻籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝優化

董　聰，李　芳，王　琳，蘇洪波，孔令明，*（.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊83005；.新疆輕工職業技術學院，新疆烏魯木齊8300）

酶解胡麻籽粕蛋白制備抗氧化肽的工藝優化

董聰1，李芳2，王琳1，蘇洪波1，孔令明1，*
（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆輕工職業技術學院，新疆烏魯木齊830021）

摘要：以胡麻籽粕蛋白粉為原料，分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及中性蛋白酶對胡麻籽粕蛋白進行酶解，以水解度為指標對酶制劑進行篩選。通過單因素及正交試驗，以抗氧化性為指標，獲取最佳酶解工藝。結果表明，堿性蛋白酶對胡麻籽粕蛋白的酶解效果較好，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工藝為：底物濃度1.5%，pH 8.5，酶底比3%，超聲波功率300 W，酶解溫度40℃、酶解時間3 h，在此條件下，胡麻籽粕多肽對O2-·和OH-·清除能力分別為42%和30%。

關鍵詞：胡麻籽粕；酶解；多肽；抗氧化活性

胡麻籽為亞麻科植物亞麻Lium usitatissimum L的干燥成熟種子，是中國五大油料作物之一，中國歷年種植面積約為60萬hm2，種子產量約為25萬t～30萬t，主要產區是山西、甘肅、內蒙古、寧夏、河北、新疆等地。種子含脂肪油，油中主要成分為亞麻酸、亞油酸、油酸及少量飽和脂肪酸的甘油酯。此外，尚含黏液質、蛋白質等。經測定去油后的胡麻籽粕中含有16.7%的胡麻籽蛋白及8.53%的粗脂肪，而長期以來胡麻籽粕多被用于肥料和飼料，造成了其中所含的優質蛋白質資源的極大浪費。科學研究發現，將蛋白質進行酶解可獲得許多具有多種生物活性的肽，其具有的生物活性包括抗氧化作用、抗病毒、抗高血壓、激素調節、免疫調節等[1]。若使用胡麻籽粕為原料制備胡麻籽蛋白抗氧化活性肽，則極大地增加了產品的附加值，故研究酶解胡麻籽蛋白制備胡麻籽多肽的工藝具有重要意義。

本研究以抗氧化活性為指標，對超聲波輔助胡麻籽粕蛋白的酶解工藝進行優化，從而提高胡麻籽粕多肽的抗氧化活性。研究成果將為胡麻綜合利用及開發功能性食品提供科學數據和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1材料與試劑

胡麻籽粕蛋白：新疆農業大學食藥學院實驗室自制；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶：均為南寧寵博生物工程有限公司提供；其它試劑均為分析純。

1.1.2儀器與設備

粉碎機：上海一恒科技有限公司；XB120A型分析天平：上海天平廠；PHS-3C雷磁：上海儀電科學儀器股份有限公司；全數字超聲波發生器：武漢嘉鵬電子有限公司；電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2試驗方法

1.2.1蛋白酶活力測定

蛋白酶活力的測定采用福林—酚法[2]。

1.2.2粗蛋白含量測定

粗蛋白含量的測定采用凱氏定氮法[3]。

1.2.3氨基氮含量的測定

氨基氮含量的測定采用甲醛滴定法[4]。

1.2.4水解度的測定[5]

水解度（DH）=樣品中的氨基氮含量/樣品中的總氮×100%

1.2.5蛋白質酶解工藝流程

胡麻籽粕蛋白→2%懸浮液→熱變性處理→調pH→酶解→滅酶→離心→取上清液

1.2.6蛋白酶的篩選[6]

選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶在最適酶解條件下對胡麻籽粕蛋白進行酶解，以水解度為指標，篩選出的最適的酶制劑。

1.2.7抗氧化能力的測定

OH-·清除能力的測定—采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[7]；O2-·清除能力的測定—采用鄰苯三酚方法[8]。

1.2.8單因素試驗

選定最佳蛋白酶后，以抗氧化性為指標，比較在酶解過程中pH、溫度、酶解時間、底物濃度、超聲波功率、酶底比對胡麻籽粕多肽抗氧化能力的影響。

1.2.9酶解工藝優化

在單因素試驗的基礎上，以抗氧化性為指標，選擇A（底物濃度）、B（pH）、C（酶底比）、D（超聲波功率）進行四因素三水平正交試驗，因素水平見表1。

表1　試驗因素水平設計Table 1　Factor level of experimental design

2　結果與分析

2.1蛋白酶活力

經測定，木瓜蛋白酶活力為10.1萬U/g，堿性蛋白酶活力為13.6萬U/g，中性蛋白酶36.6萬U/g。

2.2粗蛋白含量

根據凱氏定氮法測得胡麻籽粕蛋白質中粗蛋白含量為74.5%。

2.3酶的篩選

經測定，木瓜蛋白酶水解度為15.65%，堿性蛋白酶水解度為17.28%，中性蛋白酶水解度為16.44%。

由測定結果可知，3種蛋白酶在其最適宜條件下對胡麻籽粕蛋白進行酶解，以堿性蛋白酶酶解效果較好，故選用堿性蛋白酶作為酶解胡麻籽粕蛋白的最適酶制劑。

2.4單因素試驗結果分析

2.4.1pH對抗氧化能力的影響

在溫度50℃、酶解時間2 h、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、pH分別為8、9、10、11的酶解條件下，測定抗氧化能力如圖1所示。

圖1　pH對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.1　Effect of pH on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖1可知，當pH為9時，抗氧化能力達到最高值，pH繼續增大，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力趨于平緩，即確定酶解反應的最適pH 為9。

2.4.2酶解溫度對抗氧化能力的影響

在pH9、酶解時間2 h、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、溫度分別為30、40、50、60℃的酶解條件下，測定抗氧化能力如圖2所示。

由圖2可知，當溫度為40℃時，抗氧化能力達到最高值，溫度繼續增大，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力趨于平緩，即確定酶解反應的最適溫度為40℃。

2.4.3酶解時間對抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、底物濃度2%、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、酶解時間分別為1、2、3、4、5 h的酶解條件下，測定抗氧化能力如圖3所示。

圖2　溫度對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.2　Effect of temperature on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

圖3　時間對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.3　Effect of time on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖3可知，當時間為3 h時，抗氧化能力達到最高值，時間繼續增長，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力趨于平緩但不再增加，即確定酶解反應的最適時間為3 h。

2.4.4底物濃度對抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時間2 h、超聲波功率為400 W、酶底比為5%、底物濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的酶解條件，測定抗氧化能力如圖4所示。

圖4　底物濃度對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.4　Effect of substrate concentration on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖4可知，當底物濃度為2%時，抗氧化值達到最高，底物濃度繼續增大，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力趨于平緩但呈下降趨勢，即確定酶解反應的最適底物濃度為2%。

2.4.5超聲波功率對抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時間2 h、底物濃度2%、酶底比為5%、超聲波功率分別為200、300、400、500、600 W的酶解條件，測定抗氧化能力如圖5所示。

圖5　超聲波功率對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.5　Effect of ultrasonic power on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖5可知，當超聲波為300 W時，抗氧化值達到最高，超聲波繼續增大，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力隨之減弱，即確定酶解反應的最適超聲波功率為300 W。

2.4.6酶底比對抗氧化能力的影響

在pH9、溫度50℃、酶解時間2 h、超聲波功率為400W、底物濃度2%、酶底比分別為1%、3%、5%、7%、9%的酶解條件，測定抗氧化能力如圖6所示。

圖6　酶底比對胡麻籽粕多肽抗氧化活性的影響Fig.6　Effect of enzyme substrate ratio on anti-oxidative activity of linseed meal peptide

由圖6可知，當酶底比為3%時，抗氧化值達到最高，酶底比繼續增大，多肽對OH-·清除能力有所下降，對O2-·清除能力隨之減弱，即確定酶解反應的最適酶底比為3%。

2.5正交試驗結果分析

通過以上單因素試驗可知，pH、溫度、時間、底物濃度、超聲波功率、酶底比對胡麻籽粕蛋白酶解物的抗氧化性都有一定的影響，現以A（底物濃度）、B （pH）、C（酶底比）、D（超聲波功率）進行正交試驗。由正交試驗得胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能結果如表2所示。

根據極差R大小，得出各因素影響OH-·清除能力的次序為：D（超聲波功率）＞B（pH）＞C（酶底比）＞A（底物濃度），影響O2-·清除能力的次序為：C（酶底比）＞B（pH）＞D（超聲波功率）＞A（底物濃度）。結果表明：胡麻籽蛋白抗氧化能力的最佳工藝參數為：A1B1C2D2，即底物濃度為1.5%，pH為8.5，酶底比為3%，超聲波功率為300 W，此條件下多肽抗氧化能力最強。

對得出工藝參數進行驗證試驗，試驗結果得出胡麻籽粕多肽對OH-·和O2-·的清除能力分別為42%和30%。與正交試驗2號相比較有較大提高，說明正交試驗得出的工藝參數可靠。

表2　胡麻籽粕多肽酶解液的抗氧化性能Table 2　Antioxidant properties of linseed meal peptide

3　結論

1）各因素影響OH-·清除能力的次序為：超聲波功率＞pH＞酶底比＞底物濃度，影響O2-·清除能力的次序為：酶底比＞pH＞超聲波功率＞底物濃度。

2）在堿性蛋白酶的作用下，胡麻籽粕蛋白的最佳酶解工藝為：底物濃度2%、pH 9.5、酶底比3%、超聲波功率300 W、酶解溫度40℃、酶解時間3 h。在此條件下，胡麻籽粕多肽對OH-·和O2-·的清除能力分別為42%和30%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.028

基金項目：新疆維吾爾自治區優秀青年科技創新人才培養項目“超聲聯合超微粉碎生產胡麻籽蛋白粉的技術研究及產品開發”（2013721024）

收稿日期：2014-05-17

作者簡介：董聰（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：農產品加工及綜合利用。

*通信作者

Optimization the Process of Enzymatic Linseed Meal Protein Preparation Anti-oxidation Peptide

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，SU Hong-bo1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Linseed meal protein powder was used as raw material.Papain，alcalase，neutral protease were used respectively to linseed meal protein on enzyme.Degree of hydrolysis as an indicator for screened the enzymes. Regard antioxidant activity as an indicator for optimal enzymatic processes by orthogonal.The results showed thatalcalase was optimal protease.The optimal enzymatic process of linseed meal protein：substrate concentration 2%，pH 9.5，enzyme-substrate ratio 3%，ultrasonic power 300 W，hydrolysis temperature 40℃，hydrolysis time 3 h，under this conditions，the effects of scavenging on O2-·and OH-·were 42%and 30%.

Key words：linseed meal；enzymatic；peptides；antioxidant activity