樹莓黃酮提取工藝的響應(yīng)面法和正交法比較

楊　靜，王　茜，韓紅娟，李興嵩，張?zhí)锢颍瑒⒂榔剑?（.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原03005；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京02206）

工藝技術(shù)

樹莓黃酮提取工藝的響應(yīng)面法和正交法比較

楊靜1，2，王茜1，韓紅娟1，李興嵩1，張?zhí)锢?，劉永平1，*
（1.中北大學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，山西太原030051；2.北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京102206）

摘要：以樹莓干果為研究材料，總黃酮提取率為評價指標(biāo)。先分析了超聲時間、浸提溫度和乙醇濃度各單因素對樹莓總黃酮提取率的影響，再通過響應(yīng)面法和正交法比較最佳提取工藝和產(chǎn)率，結(jié)果顯示，響應(yīng)面法最佳工藝為超聲時間42.30 min，浸提溫度80℃，乙醇濃度51.83%（約52%），理論預(yù)測值3.83%，實際驗證值3.88%，并且超聲時間和乙醇濃度存在交互作用；SPSS正交法的最佳工藝為超聲時間40 min，浸提溫度70℃，乙醇濃度50%，實際驗證值是3.78%。雖然2種方法得出相似的最佳工藝，但響應(yīng)面法能提供更多更精確的信息，最終產(chǎn)率也略高，值得推廣。

關(guān)鍵詞：樹莓，黃酮，響應(yīng)面法，正交法

樹莓（Rubus idaeus，raspberry）是薔薇科懸鉤子屬植物，又名懸鉤子、托盤、覆盆子等，為多年生落葉灌木。果實藥食兩用，富含有機酸、維生素和黃酮等多種營養(yǎng)成分，其中黃酮類物質(zhì)有抗氧化、抗癌、抗血管增生、消炎的功效[1-2]。近年來，超聲波輔助提取方法由于操作簡單、提取時間短、得率高，且不依賴大型設(shè)備等優(yōu)點，目前廣泛運用于包括植物細(xì)胞、果實、葉片、峰膠等多種材料的黃酮和其它天然產(chǎn)物提取[2-5]，因此，本研究采用超聲波輔助提取法對樹莓干果總黃酮提取工藝進(jìn)行研究。

響應(yīng)面法采用多元二次回歸方程擬合自變量（因素）與響應(yīng)值（產(chǎn)率）之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，是解決多變量問題的又一種統(tǒng)計方法[5-6]。隨著該方法推廣，據(jù)該方法開發(fā)的軟件Design-expert也不斷更新，能提供更多信息。正交設(shè)計以拉丁方的正交性為依據(jù)，進(jìn)行有選擇的試驗，在解決多變量問題上應(yīng)用更久更廣泛。目前可以借助SPSS軟件簡化計算，便于獲得最優(yōu)的因素組合和最佳試驗結(jié)果[7-8]。本文想通過這2種試驗設(shè)計方法獲得最佳的樹莓黃酮超聲輔助提取工藝，同時探討這2種方法在尋找最優(yōu)提取條件上的優(yōu)劣。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

樹莓干果：購于太原仁和大藥房，用萬能粉碎機將其粉碎至300 μm～400 μm，存放于常溫干燥處備用。蘆丁（Rutin）：上海金穗生物科技有限公司；其它化學(xué)試劑均為分析純。

UV-9600紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；DZKW-D-1電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；JOYN-15AL超聲儀：上海喬躍電子有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮儀器廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵：鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2試驗方法

1.2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，以上溶液0、1、2、3、4、5、6 mL于10 mL刻度試管中，各加60%乙醇至6 mL，加10%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL搖勻，放置6 min，加8%氫氧化鈉試液2 mL，最后用60%乙醇溶液定容10 mL，搖勻，放置15 min，以第1瓶為空白，在510 nm波長處測吸光度。

1.2.2總黃酮含量的測定方法

抽濾濃縮總黃酮提取液后，用60%乙醇定容到100 mL容量瓶中，按1.2.1所述方法測定其吸光度。根據(jù)公式計算黃酮提取率：

式中：n為稀釋倍數(shù)；C為提取液中總黃酮濃度，mg/mL；V為提取液體積，L；m為樹莓干果的重量，g。

1.2.3單因素試驗

準(zhǔn)確稱取樹莓干果粉末5 g，置于200 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，封口。以360 W功率超聲波輔助提取30 min后，70℃恒溫浸提1 h，減壓抽濾，濃縮后用60%乙醇定容到100 mL。吸取0.3 mL于10 mL刻度試管中，按照1.2.1方法測定吸光度。由吸光度根據(jù)回歸方程計算黃酮濃度，再計算樹莓樣品中黃酮的提取率。

在考察單因素試驗時，僅改變超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）、浸提溫度（50、60、70、80、90℃）或乙醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%），其它步驟如上不變。

1.2.4響應(yīng)面法試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計以A（超聲時間）、B（提取溫度）、C（乙醇濃度）為自變量，以黃酮提取率（%）為響應(yīng)值的三因素三水平響應(yīng)面分析試驗。數(shù)據(jù)使用Design-Expert 8.0.5.1軟件進(jìn)行分析。

1.2.5正交法試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇正交法設(shè)計試驗：以A（超聲時間）、B（提取溫度）、C（乙醇濃度）設(shè)計三因素三水平正交試驗，數(shù)據(jù)使用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線

標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線見圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Rutin standard curve

從圖1中可以看出，該蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線是以蘆丁濃度作為X軸，吸光度作為Y軸，回歸方程為Y= 13.244X+0.0011，回歸系數(shù)R2=0.999 6的直線。

2.2單因素試驗結(jié)果與分析

在所選范圍內(nèi)各單因素對總黃酮提取率的影響如圖2。

分別選擇各個因素中包含最高提取率的3個水平，即超聲時間為30、40、50 min，浸提溫度為60、70、80℃，乙醇濃度為40%、50%、60%，進(jìn)行下一步試驗。

2.3響應(yīng)面法試驗設(shè)計和結(jié)果分析

2.3.1樹莓干果黃酮的提取工藝

響應(yīng)面試驗方案和試驗結(jié)果見表1。每組試驗最少重復(fù)2次。

2.3.2黃酮提取率回歸模型的建立及顯著性檢驗

采用DesignExpert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以黃酮提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y=3.61+0.23A+0.007B+0.14C+0.013AB+0.20AC+ 0.048BC-0.48A2+0.17B2-0.63C2。對該模型進(jìn)行回歸分析結(jié)果見表2。

模型的F=30.28，P<0.01，表明該模型回歸極顯著；模型失擬項F=0.60，P＞0.05，即失擬項不顯著；因變量與所考察各自變量之間的R2=0.975 0線性關(guān)系顯著，模型調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.942 8，說明該模型能解釋94.28%響應(yīng)值的變化，總體說明模型對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，可用于預(yù)測樹莓總黃酮提取最佳工藝。

圖2　各提取參數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of extraction parameters on the extraction rate of flavonoids

表1　響應(yīng)面數(shù)據(jù)方案與試驗結(jié)果Table 1　Design and results of Response Surface Methodology

表2　回歸模型的方差分析Table 2　Analysis of variance（ANOVA）for the regression equation

從方差分析結(jié)果（表2）還可知：A，C，AC，A2，B2，C2的P<0.05差異顯著性，各因素的F值大小依次是FA> FC>FB，說明超聲時間和乙醇濃度對黃酮的提取率的影響效應(yīng)顯著，并存在交互作用，而浸提溫度的影響相對較小，在所檢測范圍差異不顯著，與其它2個因素之間也不存在交互作用，這也可以根據(jù)三維響應(yīng)曲面印證，結(jié)果見圖3。

圖3　黃酮提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.3　Response surface of the extraction rate of flavonoids

隨著乙醇濃度和超聲時間變化的響應(yīng)面趨勢呈拋物線，出現(xiàn)極大值，并且曲面坡度較陡，說明AC之間存在交互作用，見圖3b；而曲面平緩，等高線稀疏，浸提溫度邊幾乎保持直線，說明AB和BC之間交互作用不明顯，即浸提溫度與超聲時間和乙醇濃度交互作用不大，見圖3a、圖3c。

據(jù)模型推測黃酮提取的最佳工藝條件理論值為：超聲時間42.30min，浸提溫度80℃，乙醇濃度51.83%，理論最高提取率3.83%。經(jīng)過3次平行驗證試驗，實際測出的黃酮提取率3.88%，比模型預(yù)測略高1.31%，說明該方程與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性。

2.4正交法試驗設(shè)計和結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定正交法試驗設(shè)計和結(jié)果見表3，每個組合重復(fù)2次。

表3　正交設(shè)計和試驗結(jié)果Table 3　Design and results of orthogonal design

據(jù)單因素統(tǒng)計分析可知各因素對黃酮提取率的影響強弱為：A2＞B2＞C2，即超聲時間40 min，乙醇濃度50%，浸提溫度70℃是提取樹莓黃酮的最佳工藝，結(jié)果見表4。

表4　正交設(shè)計單因素統(tǒng)計Table 4　Single factor statistics of orthogonal design

經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)A-超聲時間和C-乙醇濃度對試驗結(jié)果有顯著性影響，而浸提溫度在所選擇的60℃～80℃范圍內(nèi)對結(jié)果沒有顯著性影響見表5，與響應(yīng)面法分析結(jié)果一致。正交法分析中R2=0.855和R2Adj= 0.776的值較響應(yīng)面的小，說明在線性關(guān)系和數(shù)據(jù)擬合上不如響應(yīng)面。

2.5響應(yīng)面法與正交法比較

基于單因素分析，響應(yīng)面法和正交設(shè)計都能進(jìn)一步探究超聲時間、浸提溫度和乙醇濃度對樹莓總黃酮提取率的影響，并獲得最佳的提取工藝，但是各有優(yōu)劣。

表5　正交設(shè)計的方差分析Table 5　Analysis of variance（ANOVA）for orthogonal design

2.5.1試驗次數(shù)與數(shù)據(jù)信息

Design Expert軟件設(shè)計響應(yīng)面法設(shè)計三因素三水平試驗17組見表1，其中X13-X17是5組重復(fù)的中心點（中心點可選1-999的任何數(shù)據(jù)[5]，軟件默認(rèn)5），以每個組合至少重復(fù)試驗2次計算，試驗最少進(jìn)行29次。利用正交設(shè)計正交試驗9組見表3，以每個組合至少重復(fù)試驗2次計，試驗最少進(jìn)行18次，兩種方法得出的最佳工藝結(jié)果基本相同見表6。

表6　最優(yōu)工藝驗證試驗對比Table 6　Comparison of verification test results

方差分析結(jié)果都顯示超聲時間和乙醇濃度對提取率有顯著影響，而在60℃～80℃區(qū)間內(nèi)浸提溫度的影響甚小，因此在響應(yīng)面中最佳工藝中浸提溫度80℃，而正交設(shè)計的最佳工藝中浸提溫度是70℃都不影響結(jié)果。

但是響應(yīng)面法對數(shù)據(jù)的分析比較詳細(xì)，不僅可以知道各因素對提取率的影響的顯著情況，還可以進(jìn)一步分析出乙醇濃度和超聲時間之間存在交互作用，見表2和圖3b；而在現(xiàn)有的正交試驗組數(shù)不能判斷各因素之間是否存在交互作用，除非利用L18（37）設(shè)計試驗組合，那么試驗量將擴大一倍達(dá)到36次，超過響應(yīng)面試驗量，這也就喪失了目前基于L9（34）正交設(shè)計在試驗次數(shù)較少的優(yōu)勢。實際上如果在不設(shè)重復(fù)的情況下響應(yīng)面法分析軟件可用17組數(shù)據(jù)分析（或最少13組），而正交法則只能利用極差法粗略分析，通過排列比較各組數(shù)據(jù)間極差值的大小，判斷各因素不同水平之間對結(jié)果的影響大小選擇最佳工藝，不能判斷各因素的顯著水平，也無法計算誤差值[4]；如果用方差分析，則只能通過設(shè)置空白列或從A、B、C中選擇均方最小列（沒有顯著差異），設(shè)為誤差列進(jìn)行計算，這樣顯然很粗略[7]。另外，即使在四因素、五因素或者更多因素的研究中，兩種方法的試驗量和數(shù)據(jù)信息也是同理所推。

2.5.2三維模擬和理論預(yù)測

響應(yīng)面法借助軟件可以三維模擬推測出更直觀更精確的最佳工藝，并給出預(yù)測值，而正交法只能在已經(jīng)出現(xiàn)過的因素水平值之間選擇，也無法對結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。比較兩種方法得出的最佳方案的驗證試驗，結(jié)果顯示響應(yīng)面的實際結(jié)果見表6，比預(yù)測值高出1.31%，比正交法驗證結(jié)果高出2.65%。

3　結(jié)論

綜上所述：響應(yīng)面法和正交設(shè)計都能對樹莓黃酮的超聲提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化，但是響應(yīng)面法在少量增加試驗次數(shù)的情況下，能提供更多精確的數(shù)據(jù)信息，更有利于在生產(chǎn)實踐中尋找最佳工藝，節(jié)約成本，還可以模擬預(yù)測最高得率，值得推廣。樹莓黃酮最佳提取工藝為：超聲時間42.30 min，乙醇濃度51.83%（約52%），浸提溫度可控制在80℃。超聲時間和乙醇濃度對結(jié)果有顯著影響，并且存在交互作用。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.026

收稿日期：2014-09-09

基金項目：國家自然科學(xué)青年基金（No.31200462）；山西省自然科學(xué)青年基金（No.2012021029-1）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)課題（No.2013-2014）資助

作者簡介：楊靜（1977—），女（白），副教授，博士，研究方向：植物生理生化。

*通信作者

Comparison of the Optimized Total Flavonoids Extraction Process from Raspberry by Response Surface Methodology and Orthogonal Design

YANG Jing1，2，WANG Qian1，HAN Hong-juan1，LI Xing-song1，ZHANG Tian-li1，LIU Yong-ping1，*
（1.School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North）of Ministry of Agriculture P.R.China，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206，China）

Abstract：Dry raspberry fruits were used as experimental materials with the total flavonoids extraction rate as a measure indicator.Three extraction parameters including ultrasound time，extraction temperature and ethanol concentration were optimized by response surface methodology（RSM）and orthogonal design based on single factor investigations for achieving the maximum extraction rate of the total flavonoids.The results showed that the theoretical value of RSM was 3.83%under the optimum condition of ultrasound time 42.30 min，extraction temperature 80℃and ethanol concentration 51.83%（about 52%），and the actual extracting rate of the total flavonoids was 3.88%.There was the interaction between ultrasound time and ethanol concentration.Moreover，the actual extraction rate of orthogonal design under the optimum condition of ultrasound time 40 min，extraction temperature 70℃and ethanol concentration 50%was 3.78%.Although the optimum extraction conditions from two methods were the similarity，the RSM provided the more actual data information and got the higher extraction rate，which was worth of being generalized.

Key words：raspberry；flavonoids；response surface methodology；orthogonal design