基于向量-子空間夾角判據測定果凍中的色素和防腐劑

劉　柳，粟　暉，姚志湘，*，孫增強，楊德華（.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006）

基于向量-子空間夾角判據測定果凍中的色素和防腐劑

劉柳1，2，粟暉1，2，姚志湘1，2，*，孫增強1，楊德華1
（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西科技大學廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006）

摘要：基于“向量-子空間夾角”判據，建立了果凍中檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀的同時測定新方法。該方法先進行液相-光譜聯用，得到分別扣除果凍中待測組分后的本底光譜數據庫。本底庫建立后無需再進行儀器聯用累積，只需要采集標準品光譜數據和樣品光譜數據，即可準確測定樣品中待測組分含量，操作快速簡便。試驗結果表明：該方法計算結果與高效液相色譜法相比，相對誤差基本小于±5%，樣品加標回收率為95.2%～107.5%，精密度實驗相對標準偏差小于2.5%。

關鍵詞：向量-子空間夾角；判據；多波長光纖光譜儀；高效液相色譜；果凍；檸檬黃；日落黃；山梨酸鉀

果凍中最為常用的色素包括檸檬黃和日落黃，最常用的防腐劑為山梨酸鉀。目前，對這些色素和防腐劑分析檢測的主要方法為色譜類方法，包括高效液相色譜（HPLC）、薄層色譜法、和毛細管電泳法等[1-5]。高效液相色譜法是當前使用最廣泛的方法，具有操作簡便、靈敏度高等優點，但是分析一個樣本的分離時間接近15 min～20 min，大批量樣本的分析效率低，操作強度大，分析成本高。此外，陳國慶[6]采用熒光分析對常用合成食品色素進行了定性表征，傳娜[7]通過樣品處理和儀器改造消除了測量中的物理、化學干擾，對食品中的山梨酸鉀進行了光譜定量分析。姚志湘等提出采用“向量-子空間夾角”[8-11]作為判據，用于判斷組分在體系中是否存在，并將角度量度代替強度量度進行準確定量。果凍本底光譜庫和標準光譜庫建立后，只需要采集樣品光譜，無需液相分離，即可同時測定果凍中的檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀含量，分析速度快，測定效果理想。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

Maya2000紫外-可見光纖光譜儀（掃描波長范圍：190 nm～1 100 nm）：美國海洋光學公司；AL104電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津科公司；檸檬黃（AR），日落黃（AR），山梨酸鉀（AR），乙酸銨（AR）；乙腈（GR）；二次蒸餾水。

1.2方法

1.2.1標準光譜數據庫的建立

分別精確稱取0.149 5 g檸檬黃，0.150 3 g日落黃，0.125 0 g山梨酸鉀標準品于小燒杯中，用二次蒸餾水溶解，分別轉移定容至100、100 mL和250 mL容量瓶中，得到1 495 μg/mL檸檬黃標準儲備液，1 503 μg/mL日落黃標準儲備液，500 μg/mL山梨酸鉀標準儲備液。根據多波長紫外可見光譜儀的響應范圍，用二次蒸餾水依次稀釋標準母液，得到一系列不同濃度的標準溶液，再分別采集一系列不同濃度的檸檬黃標準溶液，日落黃標準溶液，山梨酸鉀標準溶液的190 nm～1 100 nm紫外可見光譜數據，經最小二乘回歸得到標準光譜數據庫v檸檬黃，v日落黃，v山梨酸鉀。

1.2.2市售果凍樣本光譜數據庫的建立

果凍樣品的處理：稱取一定量果凍，在勻漿機中均質，稱取均質后的果凍30 g，加入15 mL 20%的乙醇水溶液混勻，倒入一次性塑料杯中，置于-20℃～-30℃冰箱中冷凍2 h，冷凍處理后色素和防腐劑與果凍中的凝膠多糖類物質快速分離。取冷凍后的果凍冰渣快速抽濾，用約10 mL蒸餾水分3次淋洗，合并濾液轉移至25 mL容量瓶中，定容，得到待測的果凍樣品，分別采集190 nm～1 100 nm的果凍樣品的光譜數據a1～a5。

1.2.3本底光譜數據庫的建立

確定被測組分與本底組分完全分離的高效液相色譜條件，將液相與光譜聯用，采集市售果凍樣本經過色譜柱完全分離后的光譜數據。從光譜數據中分別扣除果凍樣品中的待測組分檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀光譜數據，分別得到不含待測組分的本底光譜數據庫N檸檬黃，N日落黃，N山梨酸鉀。

1.2.4高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）；柱溫：30℃；可見紫外光纖光譜儀掃描波長：190 nm～1 100 nm；流動相：0.01 min～9.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸銨水溶液=10∶90（體積比）；9.01 min～20.00 min，乙腈∶0.04 mol/L乙酸銨水溶液=40∶60（體積比）；20.01 min～35.00 min，乙腈∶水=10∶90（體積比）；35.01 min～60.00 min，乙腈∶水=95∶5（體積比）。

1.2.5市售果凍中檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀含量的測定

將1#～5#果凍經樣品處理方法采集紫外-可見光譜數據，導入Matlab計算平臺，選取200 nm～600 nm波段，應用空間夾角判據算法分別計算色素和防腐劑的含量。

1.2.6加標回收率試驗

在已知濃度的3份果凍樣品中分別添加一定量的檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀標準品，測定加標回收率。

2　結果與分析

2.1標準光譜庫的建立

分別配制一系列濃度為2 μg/mL～30 μg/mL的檸檬黃標準溶液、3 μg/mL～30 μg/mL的日落黃標準溶液以及濃度為2 μg/mL～10μ g/mL的山梨酸鉀標準溶液，以水為空白，分別采集不同濃度標準溶液的190 nm～1 100 nm波長范圍光譜，記入標準光譜數據庫,如圖1～圖3所示。

圖1　不同濃度檸檬黃標準溶液光譜圖Fig.1　Multi-wavelength spectral libraries of tartrazine in different concentration

3種待測組分的線性方程、相關系數及線性范圍見表1所示。

選擇200 nm～600 nm波長范圍光譜，根據函數yi= aix+bi，分別對3種標準物質進行多變量最小二乘回歸后得到標準光譜數據庫，記為v檸檬黃，v日落黃，v山梨酸鉀。

2.2建立市售果凍的光譜數據庫

在全波長下測定果凍樣品的紫外吸光度值，構成果凍樣本光譜庫，圖4為果凍樣品的紫外可見光譜圖。

圖2　不同濃度日落黃標準溶液光譜圖Fig.2　Multi-wavelength UV spectral libraries of sunset yellow in different concentration

圖3　不同濃度山梨酸鉀標準溶液光譜圖Fig.3　Multi-wavelength UV spectral libraries of potassium in different concentration

表1　檸檬黃等3種物質的線性回歸方程Table 1　Linear regression equations，correlations，ranges of the three standard components

圖4　市售果凍樣品光譜圖Fig.4　Multi-wavelength UV spectral libraries of jelly samples from the market

2.3本底光譜數據庫的建立

2.3.1建立不含待測組分的光譜數據庫

在待測組分與本底組分完全分離的高效液相色譜條件下，得到待測樣本和對照品樣本的高效液相色譜圖。圖5為待測組分對照品在254 nm處的高效液相色譜圖，兩種色素的出峰時間分別為檸檬黃4.678 min、日落黃16.299 min，防腐劑山梨酸鉀6.799 min；圖6為果凍樣本在254 nm處的高效液相色譜圖。

圖5　標準混合溶液的高效液相色譜圖Fig.5　HPLC chromatograms of the mixed standard solutions

圖6　果凍樣品的高效液相色譜圖Fig.6　HPLC chromatograms of jelly sample

經分析對比，圖6中其他的色譜峰為果凍樣本中相對于色素或防腐劑的本底物質。以待測組分檸檬黃為例，從果凍樣本的色譜圖中扣除與檸檬黃具有相同保留時間的光譜數據，其余數據為測定檸檬黃含量的本底數據；合并多個果凍樣本的本底光譜數據庫構成測定檸檬黃含量的本底光譜數據庫N檸檬黃。測定日落黃和山梨酸鉀的本底光譜庫則分別扣除日落黃純光譜以及山梨酸鉀純光譜后得到N日落黃，N山梨酸鉀。

2.3.2本底光譜數據庫的降維

液相-光譜聯用獲取的本底光譜數據庫N數據量巨大，直接采用N作為本地數據庫，運算時間長，影響了方法的時效性。以檸檬黃為例，在Matlab計算平臺，選用主成分分析[12]，在標準化的果凍樣本光譜中添加一定強度的白噪聲掩蔽不均勻噪聲和非線性因素的干擾，以二階差分值序列的折點判斷獨立變量數目，得到體系主成分數目q，所得主成分數目與二階差分值變化如圖7所示。

經圖7可判斷測定檸檬黃的本底主成份數為17，應用[U，S，V]=svd（N）對本底光譜數據庫N進行奇異值分解降維，分解后得到m階行正交矩陣U、n階列正交矩陣V和奇異值矩陣S，取U的前17列，為降維后的本底數據庫N檸檬黃，同理得到N日落黃和N山梨酸鉀。

圖7　二階差分序列變化圖Fig.7 Change of second difference successive value

2.3.3果凍中檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀含量的測定

將所述本底光譜數據庫N、標準光譜數據庫v以及果凍樣本光譜數據a導入Matlab計算平臺，應用向量-子空間夾角判據算法計算一定質量的1#-5#果凍樣本中待測組分的實際含量。再由于某些果凍中的山梨酸鉀含量高于線性范圍，故根據樣品光譜吸光度值，將果凍提取液稀釋25倍后再測定山梨酸鉀含量。采用高效液相色譜法測定結果進行對比，對比結果見表2所示。

表2　兩種方法測定果凍樣本中檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀的含量Table 2　Determinations of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate in jelly by HPLC and vector-subspace angle criterion

由表2可知，采用向量-子空間夾角判據測定計算果凍中的檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀含量，與高效液相色譜測定結果對比，相對誤差小于±6%，說明向量-子空間夾角判據方法測定結果準確。

2.3.4精密度試驗結果

對2#樣品連續采集5次多波長光譜數據，按向量-子空間夾角判據進行計算，5次測定樣品含量的平均值（C5）和相對標準偏差（RSD）如表3所示。

表3　2#樣品的相對標準偏差（n=5）Table 3　Relative standard deviation of the 2#sample（n=5）

結果表明，相對標準偏差RSD小于2.5%，方法精密度好。

2.3.5回收率實驗結果

在已知濃度的3份果凍樣品中分別添加一定量的檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀標準品，測定加標回收率，采用向量-子空間夾角判據進行計算，3種待測組分的樣品加標回收率在95.2%～107.5%之間，相對標準偏差RSD如表4所示。

表4　加標回收率實驗結果Table 4　Results of the recovery tests（n=9）

結果表明，方法的準確度較好，可適用于市售果凍中色素和防腐劑的快速同時測定。

3　結論

通過液相-紫外可見光譜聯用，一次建庫，可解決成分復雜的分析體系自配本底組分建庫不全的缺陷。對于同類樣品的測定，進行一次色譜分離后，無需再利用聯用儀器累積本底，僅通過光譜測量即可實現同類果凍中檸檬黃、日落黃和山梨酸鉀含量的同時測定，可降低機時和試劑損耗。其結果和高效液相色譜法計算結果相近，相對誤差基本小于±5.0%，樣品加標回收率為95.2%～107.5%，方法準確性和精密度較好，適用于市售果凍中色素和防腐劑的批量定量分析。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.034

收稿日期：2014-11-27

基金項目：廣西自然科學基金（2014GXNSFAA118056）；廣西科技大學科學基金（校科自1307104）；廣西大學生創新創業訓練計劃資助項目

作者簡介：劉柳（1979—），女（漢），高級實驗師，碩士，研究方向：過程分析技術。

*通信作者：姚志湘（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：過程分析技術。

Determination of Pigment and Preservative in Jelly Based on Vector-subspace Angle Criterion

LIU Liu1，2，SU Hui1，2，YAO Zhi-xiang1，2，*，SUN Zeng-qiang1，YANG De-hua1
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract：A new direct determination of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate in jelly were estabilished which was based on vector-subspace angle criterion.With HPLC-Spectrometer，the multiwavelength spectral databases of the samples background were constructed.In the samples background，the tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate had been deducted respectively from jelly samples.The spectral databases of the samples background should not be repeated by HPLC-Spectrometer once it had been constructed.Then the multi-wavelength UV spectral databases of jelly samples and the standardants were constructed by multi-wavelength spectrometer.In the study，three kinds of spectral databases were established to calculate the content of synthetical pigments and preservative in jelly quickly and simply based on Vectorsubspace angle criterion.The results showed as following：The relative error of the results of Vector-space angle criterion was less than 5.0%compared with the results of high performance liquid chromatography.The recoveries of tartrazine，sunset yellow and potassium sorbate were 95.2%-107.5%and the relative standard deviation（n=5）of precision tests were less than 2.5%.

Key words：vector-subspace angle；criterion；multi-wavelength spectral；HPLC；jelly；tartrazine；sunset yellow；potassium sorbate