女貞子中齊墩果酸提取工藝優化

郗艷麗，張啟娟，周　婧，都　耀，王舒然（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132103）

女貞子中齊墩果酸提取工藝優化

郗艷麗，張啟娟，周婧，都耀，王舒然*
（吉林醫藥學院公共衛生學院，吉林吉林132103）

摘要：以女貞子中齊墩果酸的含量為評價指標，研究提取溫度、料液比、回流次數對女貞子中齊墩果酸提取含量的影響，香草醛-高氯酸比色法測定其含量。在提取溫度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流5次的條件下，齊墩果酸的提取含量最高，可達到122.66 μg/mL，此時齊墩果酸提取率為4.066%。高效液相法驗證提取物為齊墩果酸，此時齊墩果酸DPPH自由基清除率為70.96%。

關鍵詞：女貞子；齊墩果酸；高氯酸-香草醛比色法；高效液相色譜法

女貞子在我國的大部分地方均可生長，且種植面積廣，資源豐富，東北地區亦有大面積種植。其果實中含有多種活性物質，具有豐富的食用價值和極高的營養保健功效。研究證實，齊墩果酸是女貞子中的重要活性成分之一[1]。齊墩果酸對由自由基堆積引起的記憶減退、糖尿病、高血脂、腫瘤等疾病的防治效果明顯[2-5]。此外，齊墩果酸的毒副作用小、安全性高，已成為醫學、藥學和食品保健科學的研究熱點[6]。齊墩果酸的用途廣，市場需求量大，從天然植物中提取的齊墩果酸更是供不應求[7]。因此，對齊墩果酸提取工藝的研究仍有非常重要的意義。本研究主要以女貞子為原料，通過對女貞子中齊墩果酸的提取和鑒定，建立了一種簡便易行、低廉高效的齊墩果酸提取工藝，以滿足對齊墩果酸的需求。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

女貞子：購買自吉林市某藥房；齊墩果酸標準品[標準品號為：GBW（E）100141]：購于中國生物制品研究所。

無水甲醇、乙酸乙酯、高氯酸、香草醛、氫氧化鈉等試劑皆為分析純，購于天津市大茂化學試劑廠；高效液相用甲醇為色譜純，購于天津市永大化學試劑有限公司。

1.1.2儀器

202-1型電熱恒溫干燥箱：天津市泰森特儀器有限公司；CN-500A多功能中藥粉碎機：中南制藥機械廠；FA1104電子天平：上海精密科學儀器有限公司；索氏提取器：上海欣榮儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；722型可見光分光光度計：上海菁華科技實業有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-IIIA循環水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設備有限公司；1260高效液相色譜儀：安捷倫；UV-1800紫外分光光度儀：日本島津。

1.2工藝流程

1.2.1原料預處理

女貞子在60℃條件下干燥，多功能粉碎機粉碎，過40目篩，制成女貞子粉末，密封干燥儲藏，備用。

1.2.2提取工藝

準確稱取女貞子粉末，濾紙包成紙包置于索氏提取器中，加入甲醇溶劑進行回流提取，收集提取液于旋轉蒸發儀中進行減壓蒸餾，浸出膏用香草醛-高氯酸溶解并定容，加入乙酸乙酯終止反應，比色法測定浸出膏中齊墩果酸的含量。

1.3齊墩果酸標準曲線的繪制

1.3.1測定波長的選擇

取齊墩果酸標準品5 mg置于潔凈干燥試管中，加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液（1∶4，體積比）定容至20 mL，配成濃度為0.25 mg/mL的標準品使用液，紫外分光光度計在全波長范圍內進行波譜掃描，在波長560 nm處獲得最大吸收峰。

1.3.2標準曲線的繪制

取6支潔凈干燥的試管，分別加入配制好的0.25 mg/mL標準品使用液0、1、1.5、2、2.5、3 mL于試管中，再分別加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液5、4、3.5、3、2.5、2 mL，充分搖勻，在70℃水浴下加熱10 min，冷卻至室溫，迅速在各管中加入乙酸乙酯4 mL搖勻，即得齊墩果酸標準系列溶液，在波長560 nm波長下測其吸光度值，并以濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程和相關系數（R2）。

1.4單因素試驗

1.4.1提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響

準確稱取女貞子粉末3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，分別在80、85、90、95、100℃條件下進行回流提取。回流2次后取出冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，再經旋轉蒸發至干得浸出膏，分別加入5%香草醛冰醋酸溶液和高氯酸混合液（1∶4，體積比）定容至10 mL，再加入乙酸乙酯終止反應，70℃水浴15 min，在波長560 nm下測吸光度，計算提取含量。

1.4.2料液比對齊墩果酸提取含量的影響

準確稱取女貞子粉末1、1.2、1.5、2、3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴溫度下回流提取2次，取出冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，剩余步驟同“1.4.1”，計算提取含量。

1.4.3回流次數對齊墩果酸提取含量的影響

準確稱取女貞子粉末3 g，加入無水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴溫度下回流提取，回流次數分別為1、2、3、4、5次。提取結束后冷卻過0.22 μm孔徑的濾膜，剩余步驟同“1.4.1”，計算提取含量。

1.5正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、料液比、回流次數為考察條件，每個因素選3個條件作為考察條件，并以L9（34）正交表進行正交試驗，以提取含量為考察指標，篩選最佳提取條件，并按下列公式計算齊墩果酸的提取率。

提取率/%=（C/M×103）×100

式中：C為依據標準曲線計算出提取液中齊墩果酸含量，μg/mL；M為女貞子樣品的質量，g。

1.6驗證試驗

1.6.1高效液相法鑒定提取樣品

取齊墩果酸標準品2 mg，加入色譜甲醇溶液定容至10 mL，過0.22 μm孔徑微孔濾膜，超聲40℃、脫氣20 min，手動進樣，測定齊墩果酸標準品。提取液經旋轉蒸發儀旋轉蒸發至干，加入色譜甲醇定容至10 mL，其余處理方法同標準品。

高效液相色譜條件：色譜柱：DiamonsilC18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇：水為（16∶80，體積比）mL；檢測波長：220 nm；流速：1.0 mL/min；室溫；進樣量：20 μL。

1.6.2DPPH自由基清除能力的測定

選取最佳提取條件提取齊墩果酸，旋轉蒸發至干后加入95%乙醇充分溶解并定容至10 mL。取潔凈干燥的試管4支，分別標記為0、1、2、3號，在0號管中加入95%乙醇3 mL，在1號管中按0.8∶5（體積比）的比例加入提取液及95%DPPH溶液，在2號管中加入相同比例的提取液及95%乙醇，在3號管中加入相同比例的95%乙醇及95%DPPH溶液，充分搖勻。37℃水浴30 min，冷卻至室溫，在517 nm波長下測定吸光度并計算清除率。

清除率（R）/%=[1-（Ai-Aj）/AC]×100

式中：Ac為不含DPPH的空白溶液吸光度；Ai為加入提取液后DPPH溶液的吸光度；Aj為沒有加提取液的DPPH溶液吸光度。

2　結果與討論

2.1齊墩果酸標準曲線的繪制

以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制齊墩果酸的標準曲線如圖1。

圖1　齊墩果酸標準曲線Fig.1　The standard curve of oleanolic acid determination

經線性回歸分析得回歸方程：Y=0.006 4X-0.127 2，R2=0.998 0，齊墩果酸在50 μg～150 μg范圍內呈良好線性關系。

2.2單因素試驗

2.2.1提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響

提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響結果見圖2。

圖2　提取溫度對齊墩果酸提取含量的影響Fig.2　Effect of extraction time on oleanolic acid yield

提取溶劑的選擇對提取時間有很大的影響。可供選擇的提取溶劑有很多種，利用甲醇、乙醇或石油醚提取齊墩果酸的方法都有過報道[8-10]。其中石油醚毒性大，容易揮發，安全性低，不便于試驗所用。乙醇沸點高，難以考慮低溫條件對提取率的影響，而甲醇比乙醇沸點低，毒性比石油醚小，能滿足試驗要求。因此，選擇甲醇為提取溶劑。此外，溫度對齊墩果酸的提取也有很大影響。齊墩果酸具有很強的抗氧化活性[11]，對炎癥反應也有抑制作用[12]，溫度過高，會導致提取物活性的失活。適宜的提取溫度，既會獲得較高含量的齊墩果酸提取物，又能保護提取物的活性。

由圖2可看出，隨著提取溫度的不斷升高，齊墩果酸提取含量逐漸減小，提取溫度為80℃時提取含量最大，85℃、90℃次之，95℃最低，但100℃時提取含量有所提高，但仍比90℃時的提取含量低，可能是溫度過高導致齊墩果酸的結構被破壞，影響了提取的效果。

2.2.2料液比對齊墩果酸提取含量的影響

料液比對齊墩果酸提取含量的影響結果見圖3。

圖3　料液比對齊墩果酸提取含量的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on oleanolic acid yield

料液的比例會影響齊墩果酸的提取含量，合適的料液比會使女貞子粉末充分分散，接觸有機溶劑，提高齊墩果酸的提取效率，降低溶劑的消耗，減少成本，同時也可以避免大量廢棄的溶劑污染環境[13]。研究結果顯示，當料液比為1∶20（g/mL）時，齊墩果酸提取含量最大。隨著溶劑使用量的增大，提取含量反而下降，當料液比為1∶60（g/mL）時的提取含量最低。這一結果表明，大量使用溶劑不會獲得高含量的齊墩果酸提取物，料液比為1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）這3個條件下獲得的齊墩果酸含量符合要求，因此這3個水平可以被列入正交因素的考查水平。

2.2.3回流次數對齊墩果酸提取含量的影響

回流次數對齊墩果酸提取含量的影響結果見圖4。

圖4　回流次數對齊墩果酸提取含量的影響Fig.4　Effect of reflux times on oleanolic acid yield

研究結果表明，回流次數與齊墩果酸的提取含量呈正相關，回流次數為3、4、5次時，獲得的提取物中齊墩果酸的含量分別為88.82、96.76、121.53 μg/mL。回流次數越多，齊墩果酸提取物的含量越高。

2.3正交試驗

在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，選取提取溫度、料液比、回流次數為考察因素，每個因素選取3個水平以L9（34）進行正交試驗，因素水平表見表1，以提取含量為考察指標，篩選最佳提取條件，結果見表2。

表1　齊墩果酸正交試驗因素水平表Table 1　Level of orthogonal examination

由表2可知，極差的大小順序為C＞B＞A，因此女貞子中齊墩果酸提取工藝影響因素的主次順序也為C＞B＞A，即索氏提取的回流次數對提取含量影響最大，料液比次之，提取溫度最小。最佳組合條件為A2B2C3，即提取溫度為85℃，料液比為1∶30（g/mL），回流次數為5次，在此條件下，女貞子中齊墩果酸的提取含量為122.66 μg/mL，最優條件齊墩果酸的提取率為4.066%。

表2　正交試驗結果Table 2　Result of orthogonal examination

2.4驗證性試驗

2.4.1高效液相法鑒定提取樣品

高效液相法鑒定提取樣品結果見圖5。

高效液相色譜法檢測結果表明，提取樣品（如圖5 中2所示）的出峰時間與齊墩果酸標準品（如圖5中1所示）出峰時間相一致，進一步驗證了提取樣品的主要成分是齊墩果酸。

2.4.2齊墩果酸對DPPH自由基清除作用測定

加入樣品后DPPH溶液的吸光度（Ai）為0.249，不含DPPH的空白溶液吸光度（Ac）為1.295，沒有加樣品的DPPH溶液吸光度（Aj）為0.168，計算求得DPPH自由基的清除率為70.96%。這表明提取物對DPPH自由基有明顯的清除作用，這一結果與文獻報道的一致[14]，可判斷從女貞子中提取的物質是齊墩果酸。

圖5　齊墩果酸標準品和提取樣品色譜圖Fig.5　HPLC chromatograms of oleanolic acid standard and extraction sample

3　結論

影響女貞子齊墩果酸提取含量的因素（提取溫度、料液比和回流次數）中，回流次數為主要影響因素，料液比為次要影響因素，提取溫度對提取含量的影響最小。通過正交試驗得到了女貞子齊墩果酸的最佳提取工藝條件：提取溫度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流次數5次，在此條件下的齊墩果酸的提取含量為122.66 μg/mL，提取率為4.066%。通過高效液相色譜法和自由基清除率檢測法進一步驗證了提取物為齊墩果酸。試驗結果表明，正交試驗法能夠優化女貞子齊墩果酸的提取工藝，獲得較高純度的齊墩果酸提取物。

參考文獻：

[1]朱沛沛,楊鵬,郝歡,等.響應面法優化女貞子中齊墩果酸提取工藝的研究[J].杭州化工,2013,43(2):20-23

[2]吳勃巖,王雪,董靜,等.齊墩果酸對S180荷瘤小鼠細胞色素C和Caspase-3表達的影響[J].中醫藥信息,2014,31(4):14-16

[3]Mapanga RF,Rajamani U,Dlamini N,et al.Oleanolic acid:a novel cardioprotective agent that blunts hyperglycemia-induced contractile dysfunction[J].Plus one,2012,7(10):e47322-e47322

[4]張琳琳,張素玲,張玉蓮,等.齊墩果酸對快速老化小鼠海馬神經元及APP/PS1基因表達的影響[J].中國老年學雜志,2014,34(21): 6089-6091

[5]Tsai SJ,Yin MC.Anti-oxidative,anti-glycative and anti-apoptotic effects of oleanolic acid in brain of mice treated by D-galactose[J]. European journal of pharmacology,2012,676(1/3):81-88

[6]何琨,張妍,張藍可,等.齊墩果酸對小鼠成纖維細胞L929的影響[J].時珍國醫國藥,2013,24(2):281-283

[7]王巧云,李丙華,朱莉,等.齊墩果酸對氧化損傷模型人臍靜脈內皮細胞的保護作用[J].中國藥房,2014,25(43):4033-4035

[8] 周吳萍.絲瓜藤和葉中齊墩果酸的提取與含量分析[J].廣西科技大學學報,2014,25(2):86-89

[9]黃新蘋,可鈺,馮凱,等.女貞子石油醚提取物的化學成分研究[J].中國藥學雜志,2011,46(13):984-987

[10]李成,何義,陳燦,等.HPLC-MS法測定棗中的齊墩果酸和熊果酸[J].食品研究與開發,2013,34(15):75-77

[11]魏海珍,張秀峰.齊墩果酸對損傷血管內皮細胞的保護作用及其機制探討[J].南京醫科大學學報(自然科學版),2012,32(11):1505-1510

[12]Lee W,Yang EJ,Ku SK,et al.Anti-inflammatory effects of oleanolic acid on LPS-induced inflammation in vitro and in vivo[J].Inflammation,2013,36(1):94-102

[13]曹艷萍,楊秀利,薛成虎.紅棗中齊墩果酸提取工藝的研究[J].食品科學,2007,28(10):165-167

[14]戴云,邱曉燕,何耀瑩,等.齊墩果酸和熊果酸對DPPH自由基的清除作用[J].云南民族大學學報(自然科學版),2012,21(6):395-398

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.011

收稿日期：2015-01-08

基金項目：吉林省衛生計生委吉林省財政廳資助項目（2014ZC063）

作者簡介：郗艷麗（1981—），女（漢），講師，博士，從事食品毒理學研究。

*通信作者：王舒然（1968—），男（漢），教授，博士，從事食品營養學研究。

Study on Optimum Extraction Process of Oleanolic Acid from Ligustrum Lucidum Ait

XI Yan-li，ZHANG Qi-juan，ZHOU Jing，DU Yao，WANG Shu-ran*
（School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：With the content of oleanolic acid from ligustrum lucidum ait as evaluating indicator，the effect of extraction temperature，solid-liquid ratio and reflux times on the extraction content was considered.The contents of oleanolic acid were measured by vanillin-perchlorate colorimetry.The optimal extraction processes were as follows：extraction temperature of 85℃，solid-liquid ratio of 1∶30（g/mL）and reflux times of five.In these conditions，the extraction content of oleanolic acid was 122.66 μg/mL，and the extraction ratio was about 4.066%.Then the extraction was identified as oleanolic acid by HPLC method，and the scavenging rate of DPPH was 70.96%.

Key words：ligustrum lucidum ait；oleanolic acid；vanillin-perchlorate colorimetry；HPLC method