RunX2的真核表達載體的構建及其對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響

趙　明，范楚玲，郭　強，汪思應，李菲菲

RunX2的真核表達載體的構建及其對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響

趙明，范楚玲，郭強，汪思應，李菲菲

摘要目的構建人RunX2真核表達載體，觀察RunX2對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響。方法運用逆轉錄PCR （RT-PCR）擴增、酶切、連接等基因重組技術將人RunX2基因插入pcDNA3．1真核表達載體中；并經酶切、PCR、測序鑒定；將構建的RunX2真核表達載體瞬時轉染MCF-7細胞，利用Western blot法檢測RunX2蛋白表達，用MTT實驗和細胞劃痕實驗檢測其對乳腺癌細胞的生物學影響。結果構建的RunX2真核表達載體在MCF-7細胞中高表達RunX2蛋白；發現高表達RunX2的MCF-7細胞活力增加，移動能力增強。結論構建的RunX2真核表達載體能促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。

關鍵詞RunX2；乳腺癌

2015-07-31接收

汪思應，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：sywang ＠ahmu．edu．cn；

李菲菲，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：349711832＠qq．com

RunX2是一種參與成骨分化和骨發育的重要轉錄因子［1］。在乳腺組織中，RunX2也參與某些基因的表達調控，在乳腺上皮細胞分化中發揮重要作用，并與乳腺腫瘤細胞株的侵襲性密切相關［2］。本課題組研究顯示RunX2通過調節血管生成相關基因的表達促發乳腺癌細胞發生骨轉移（待發表）。這一結果提示RunX2可能成為乳腺癌骨轉移的一個標志物。為進一步探討RunX2與乳腺癌侵襲轉移的關系，該研究利用亞克隆技術構建人RunX2真核表達載體，并通過瞬時轉染至乳腺癌細胞MCF-7中，以探討RunX2對乳腺癌細胞的影響，初步了解其在乳腺癌侵襲轉移中的機制。

1　材料與方法

1．1細胞系人乳腺癌細胞系MCF-7、MB-231細胞由本室長期保存。培養條件：配制含有DMEM、10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的完全培養基，將細胞置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養。

1．2主要試劑和儀器根據NCBI Reference Sequence軟件分析設計RunX2引物，引物由Invitrogen公司合成，PCR反應試劑、DNA限制性內切酶及DNA Marker購于TaKaRa公司，DMEM、胰酶、FBS均購于Gibco公司，Western blot相關試劑購于上海生物工程公司，RunX2抗體購于美國Abcam公司，PVDF膜購于Millipore公司。PCR儀為BIO-RAD公司產品。?

1.3PCR擴增提取人乳腺癌細胞MB-231的總RNA，以此為模板行RT-PCR擴增RunX2片段。引物：上游3′-CCG CTCGAG ATG GCA TCA AAC AGC CTC-5′；下游3′-TCC CCG CGG ATA TGG TCG CCA AAC AGA-5′（下劃線部分為酶切位點）。PCR反應體系：25μl，變性溫度98℃10 s，退火溫度55℃5 s，延伸溫度72℃10 s，反應35個循壞。PCR產物經1%的瓊脂糖電泳發現一條1 kb左右的片段?；厥彰盖泻蠼洔y序鑒定。

1.4人RunX2真核表達載體的構建將上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA連接酶鏈接于pcDNA3．1真核表達載體，鏈接產物做小規模細菌轉化，PCR及雙酶切后經測序鑒定證實。

1.5pcDNA3.1-RunX2瞬時轉染 MCF-7細胞1 ×106個細胞接種于90 mm平皿，待貼壁后長至70%密度時進行轉染pcDNA 3．1-RunX2質粒10 μg、脂質體12μl與無血清opti-MEM混勻后輕覆細胞，轉染6 h后換成含10%FBS的 DMEM培養48 h，加入細胞蛋白裂解液RIPA（97．5%PBS、1% NP40、0．5%脫氧膽酸鈉、0．1%SDS）冰上裂解30 min，4℃離心取上清液，提取總蛋白（10μg／組）。經10%SDS-PAGE膠分離后，電轉（200 mA、120 min）至PVDF膜上。膜用TBST（20 mmol／L Tris-HCl、pH 7．4，150 mmol／L NaCl，0．05%Tween 20）封閉，3 h后置于含抗 RunX2抗體（1：1 000）的TBST中4℃孵育過夜，再加入相應結合的二抗后與ECL發光檢測劑結合顯示結果。

1．6細胞生物學檢測

1．6．1MTT法檢測細胞活力將pcDNA3．1-RunX2真核表達質粒瞬時轉染至MCF-7細胞中，促使細胞中的RunX2表達上調，通過MTT實驗檢測其細胞活力的變化，常規的消化、計數處于對數生長期的各實驗組細胞，并將細胞接種于96孔板中，按照每孔2 000個細胞進行接種，每種細胞設置5個復孔。分別標記為0、24、48 h，共3塊板，將96孔板放入培養箱中，待細胞貼壁后，取0 h的96孔板，在避光條件下加入MTT溶液后繼續孵育，4 h后收取0 h的板，將上清液倒去，每孔加入DMSO溶解結晶，混勻，酶標儀檢測550 nm處光密度（optical density，OD）值。第2天相同時間加MTT，收板后測OD值，以此類推。每組實驗均重復3次。

1．6．2細胞劃痕實驗通過細胞劃痕實驗檢測其細胞移動能力的變化，取6孔板于生物安全柜內操作，用直尺在每孔底部至少劃三條線作為標記，然后消化對數期生長的細胞，接種于6孔板內，每孔約3 ×105個細胞。將6孔板放入細胞培養箱培養24 h，待細胞達到80%以上的融合率時，將細胞置于生物安全柜內操作。用20μl白槍頭垂直于6孔板橫線劃痕，至少劃三道痕。用PBS輕洗去劃下的細胞，于相差顯微鏡下拍照，記為0 h。放入細胞培養箱中培養，每隔24 h，在同一位置拍照，以觀察細胞的移動情況。每組實驗重復3次。

2　結果

2.1構建人RunX2真核表達載體首先用逆轉錄PCR（RT-PCR）法得到RunX2的基因片段，PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳發現一條1 kb左右的片段，見圖1。將上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA連接酶鏈接于pcDNA3．1真核表達載體，鏈接產物做小規模細菌轉化，PCR及EcoRⅠ和SacⅡ雙酶切后經測序鑒定證實，見圖2。

2.2轉染pcDNA3.1-RunX2的細胞高表達RunX2

pcDNA3．1-RunX2瞬時轉染至低表達 RunX2的MCF-7細胞中，轉染后48 h Western blot檢測發現轉染細胞中RunX2高表達，由圖可以看出轉染組中的RunX2蛋白表達高于未轉染組。見圖3。

2.3RunX2促進人乳腺癌細胞的活力及移動能力

將構建好的pcDNA3．1-RunX2瞬時轉染至MCF-7細胞中，轉染48 h后通過Western blot檢測其轉染效率，見圖3。收集細胞，MTT法檢測其細胞活力發現，與未轉染組相比，轉染組細胞活力明顯增加。與未轉染組相比，轉染組增殖能力增加，差異有統計學意義（P＜0．001），見圖4。通過劃痕實驗檢測其移動能力發現，與未轉染組相比，轉染組的MCF-7細胞移動能力明顯增加。與未轉染組相比，24 h劃痕內遷移細胞數目明顯增加，差異有統計學意義（P＜0．01），見圖5。

3　討論

RunX2不僅調節成骨細胞分化，而且與乳腺癌發生骨轉移密切相關［3］。RunX2通過調節血管生成相關基因的表達促發乳腺癌細胞發生骨轉移。骨涎蛋白（BSP）與導管內轉移性乳腺癌相關，可能在誘導乳腺癌細胞定向骨轉移過程中發揮作用，骨橋蛋白（OPN）可以介導乳腺癌骨轉移中腫瘤細胞與骨組織表面的連接，并且與骨轉移中破骨細胞引發骨吸收活性增加相關。RunX2是骨髓間質干細胞成骨分化和骨發育的重要轉錄因子，它通過促進溶骨作用、腫瘤血管新生等多個途徑轉移癌細胞的生長［4-6］。RunX2已被證明在成骨與骨肉瘤的發生發展過程中起重要作用［7］。Runx2還被報道在臨床預后差的乳腺癌中高表達［8］。最近，McDonald et al［9［10-13］顯示，參與骨侵襲的幾個基因，如血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶（MMPs）、VEGF、OPN和BSP都是通過RunX2調節的，表明這個轉錄因子可能有助于乳腺腫瘤骨轉移。這與本實驗中提到的RunX2沉默降低轉移性乳腺癌細胞系MB-231細胞的遷移和侵襲能力一致。此外，RunX2亦可調節MMPs家族中的其他基因，在MDA-MB-231中，利用小干擾RNA沉默RunX2表達可降低MMP-9的表達，并減弱癌細胞的侵襲能力，提示RunX2與乳腺癌轉移密切相關［14］。

RunX2在乳腺癌的侵襲轉移中的作用機制仍存爭議。但是，在RunX2所表達的MDA-MB-231細胞株中，以上骨細胞分化效應并未出現。研究［15］表明，在MDA-MB-231細胞株中，RunX2調節 OPN基因的表達，并可持續激活BSP使其表達異常，抑制RunX2的表達可導致OPN和BSP的表達明顯下調，提示RunX2在乳腺癌轉移中發揮著重要作用。多數學者認為，RunX2能夠調節一系列基因的轉錄進而影響乳腺癌細胞的侵襲能力，在乳腺癌發生骨轉移的過程中起重要作用，且與其預后密切相關。

本研究構建的RunX2真核表達載體通過瞬時轉染至乳腺癌細胞MCF-7中，并通過Western blot檢測發現轉染后的細胞高表達RunX2，說明成功構建了pcDNA3．1-RunX2真核表達載體。MTT實驗證實過表達RunX2促進了細胞增殖，但是劃痕試驗中，劃痕愈合是因為增殖促進劃痕愈合還是因為過表達RunX2促進細胞遷移尚未明確，在后續的實驗中，將通過Transwell實驗進一步驗證。

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Construction of RunX2 eukaryotic expression vector and study the proliferations and m igrations effective of RunX2 on breast cancer cells

Zhao Ming，Fan Chulin，Guo Qiang，et al
（Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the biology effectof RunX2 gene after constructing the eukaryotic expression vector of human RunX2 in breast cancer cells．MethodsBy the recombinant techniques such as PCR amplification，digestion，ligation，the human RunX2 gene was inserted into the eukaryotic expression vector of pcDNA3．1，and then itwas identified by restriction enzyme digestion，RT-PCR，sequencing．Eukaryotic expression vector of human RunX2 gene was transiently transfected into MCF-7 cells．Western blot analysis was applied to detect the expression of RunX2 protein in breast cancer cellsMCF-7；MTT assay and wound healing assaywere used to detect the cells proliferation and invasion of MCF-7．ResultsOur result showed that the eukaryotic expression vector of RunX2 was highly expressed RunX2 protein in MCF-7 cells，the cell proliferation and migration abilities were enhanced in MCF-7 cells with high expression of RunX2 protein．ConclusionRunX2 constructs eukaryotic expression vector and promotesmalignant behavior of breast cancer cells．

Key wordsRunX2；breast cancer

中圖分類號R 349．5

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1593-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：81302319）

作者單位：安徽醫科大學病理生理學教研室，合肥230032

作者簡介：趙明，男，碩士研究生；