TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾素中的作用

何漢文，王　蔥，杜博易，吳　璇，于　莉，汪旻旻，黃升海

TLR7在呼吸道合胞病毒感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)I型干擾素中的作用

何漢文1，王蔥2，杜博易2，吳璇1，于莉1，汪旻旻1，黃升海1

摘要目的探討Toll樣受體7（TLR7）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染A549細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素（IFN）抗病毒免疫反應(yīng)中的作用。方法實(shí)驗(yàn)分正常對照組、RSV感染組、TLR7 siRNA沉默組，分別于感染的4、8、12、24 h后收集各組細(xì)胞以及培養(yǎng)上清液。TLR7 siRNA通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，半定量RT-PCR法檢測TLR7基因沉默效果；TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，檢測TLR7、干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）、IFN-α、IFN-β的mRNA表達(dá)量變化；通過Western blot法檢測TLR7蛋白表達(dá)量；ELISA法檢測感染不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFNα／β含量的變化。結(jié)果①轉(zhuǎn)染24 h后TLR7 siRNA-2有效抑制TLR7mRNA表達(dá)；②RSV感染A549細(xì)胞后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的 mRNA以及 TLR7蛋白的表達(dá)量均升高，并與RSV感染之間存在時(shí)間依賴性關(guān)系；沉默TLR7后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA以及TLR7蛋白的表達(dá)量較感染組均有明顯下降；③RSV感染A549細(xì)胞后，明顯上調(diào)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的水平，TLR7 siRNA沉默組IFN-α／β的表達(dá)水平較RSV感染組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且IFN-α的表達(dá)量下調(diào)更為顯著。結(jié)論RSV感染A549細(xì)胞后，TLR7被活化能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN，發(fā)揮抗病毒作用，且TLR7誘導(dǎo)產(chǎn)生的I型IFN以IFN-α為主。

關(guān)鍵詞呼吸道合胞病毒；A549細(xì)胞；Toll樣受體7；siRNA；I型干擾素

2015-06-20接收

黃升海，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：huangshh68＠aliyun．com

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是一種有包膜單負(fù)鏈的RNA病毒，屬于副黏病毒科肺炎病毒屬［1］，是世界范圍內(nèi)嬰幼兒嚴(yán)重下呼吸道感染（包括肺炎和細(xì)支氣管炎）的最常見病原體［2-3］。目前RSV感染的病理機(jī)制尚不明確，迄今仍無理想的治療藥物和疫苗。Toll樣受體7（Tolllike receptor 7，TLR7）可通過識別病毒的單股RNA而活化細(xì)胞［4-5］，誘導(dǎo)I型干擾素（interferon，IFN）產(chǎn)生，活化核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor ofκB，NF-κB）的表達(dá)，從而介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過RNAi沉默TLR7表達(dá)，研究RSV感染A549細(xì)胞后TLR7的活化，探討其活化所介導(dǎo)的I型IFN產(chǎn)生機(jī)制及其抗病毒作用，為臨床RSV感染的預(yù)防與治療提供思路。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細(xì)胞和病毒人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549、人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2）和RSV-Long株（國際標(biāo)準(zhǔn)株）均由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。

1．1．2主要試劑DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季清公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；TLR7 siRNA（上海百奧邁科生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas公司）；IFN-α／β酶聯(lián)檢測試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；抗TLR7抗體、抗β-actin（美國Santa Cruz公司）；HRP-羊抗兔IgG（碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他試劑為市售分析純。

1．2方法

1．2．1病毒感染量測定將凍存的RSV-Long株與37℃水浴復(fù)蘇后經(jīng)Hep-2細(xì)胞增殖，病變達(dá)80%～90%時(shí)收獲病毒，-80℃保存?zhèn)溆?。空斑形式試?yàn)（plaque forming unit，PFU）檢測病毒增殖滴度為1．55×108／ml。

1．2．2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組將凍存的A549細(xì)胞復(fù)蘇后接種于細(xì)胞瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80%～90%用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分正常對照組（同等條件下培養(yǎng)的未感染病毒細(xì)胞）、RSV感染組、TLR7 siRNA沉默組（TLR7 siRNA ＋RSV組）。

1．2．3細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化與轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，制備成單細(xì)胞懸液接種于96孔板，用不含抗生素的含血清的DMEM培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%時(shí)，棄去含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行轉(zhuǎn)染，Lipofectamine 2000與帶有FAM標(biāo)記的siRNA分別用opti-MEM進(jìn)行稀釋，孵育20 min后，形成Lipofectamine2000-siRNA復(fù)合物，均勻加入培養(yǎng)基，放入CO2孵箱中培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，用于優(yōu)化細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件。

以TLR7為靶向沉默基因，設(shè)計(jì)并合成3條TLR7 siRNA干擾序列以及1條siRNA空白對照序列，取轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，利用RTPCR法檢測TLR7 mRNA的表達(dá)，篩選出能有效抑制TLR7基因的干擾序列，以期達(dá)到阻斷TLR7信號通路的目的。

1．2．4TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β的mRNA水平檢測收集細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)法檢測RNA的純度與濃度，取1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)試劑盒說明書程序進(jìn)行：42℃45 min，95℃5 min，4℃5 min合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄結(jié)果體系按1∶5稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以人β-actin的mRNA表達(dá)作為內(nèi)參。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳分析，經(jīng)凝膠成像分析儀掃描拍照后，用Labworks軟件分析測定條帶的灰度值，以目的基因與β-actin的比值對mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。各基因的引物序列和擴(kuò)增片斷長度見表1，各基因的PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，退火時(shí)間為45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，TLR7、IRF7、IFN-α、IFN-β、βactin退火溫度為：55℃、55℃、57．7℃、57℃、49．4℃。

表1　人各基因的引物序列和擴(kuò)增片段大小

1．2．5不同感染條件下各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TLR7蛋白的表達(dá)分別收集正常對照組和不同感染條件各組不同時(shí)間點(diǎn)的A549細(xì)胞并進(jìn)行裂解，冰上孵育30 min后，離心收集上清液，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉，室溫下封閉1 h，分別加入TLR7（1∶500）、β-actin（1∶500）一抗，4℃孵育過夜。洗膜后，ECL顯影后曝光并顯影，用Labworks軟件分析測定灰度值，進(jìn)行分析。

1．2．6不同條件下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的表達(dá)收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，離心后去除沉淀，分裝EP管，-80℃保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融。嚴(yán)格按照ELSIA試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀讀取吸光度值，計(jì)算出IFN-α／β的表達(dá)水平。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2．1轉(zhuǎn)染效率的檢測利用熒光顯微鏡觀察FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的FAM標(biāo)記的綠色熒光，普通光源下的A549細(xì)胞對比熒光明場下的綠色熒光細(xì)胞，siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90%（圖1），初步認(rèn)為設(shè)計(jì)合成的FAM-siRNA已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。

2.2TLR7 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后TLR7mRNA表達(dá)情況TLR7 siRNA-1、TLR7 siRNA-2、TLR7 siRNA-3和siRNA空白對照分別轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24 h后對TLR7基因進(jìn)行RT-PCR檢測結(jié)果顯示，TLR7 siRNA-2組較其他組抑制作用最強(qiáng)，可以更有效地抑制TLR7 mRNA的表達(dá)，后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選擇TLR7 siRNA-2為最佳的轉(zhuǎn)染序列（圖2）。

2.3RSV感染不同時(shí)間點(diǎn)各組TLR7 m RNA的表達(dá)RT-PCR測定結(jié)果顯示，正常對照組的A549細(xì)胞的 TLR7表達(dá)很低；在RSV感染組TLR7 mRNA的表達(dá)量隨時(shí)間延長而逐漸增加，有時(shí)間依賴性；與正常對照組比較，感染4 h后A549細(xì)胞中的TLR7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默組，TLR7 mRNA的表達(dá)水平雖有所增加，但較RSV感染組同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝35．08，P＜0．01），見圖3。

2.4不同時(shí)間點(diǎn)各組IRF7 mRNA的表達(dá)正常對照組A549細(xì)胞中的IRF7 mRNA表達(dá)量較低；與正常對照組比較，RSV感染組IRF7mRNA表達(dá)量可隨時(shí)間延長呈上調(diào)趨勢；在RSV感染A549細(xì)胞4 h后，各時(shí)間點(diǎn)IRF7 mRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默組，IRF7 mRNA表達(dá)盡管有上升的趨勢，但較RSV組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝29．91，P＜0．01），見圖4。

2.5IFN-αmRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)RT-PCR測定結(jié)果顯示，正常對照組中IFN-αmRNA的表達(dá)量很低；RSV感染組與正常對照組比較，IFN-αmRNA的表達(dá)量升高且有時(shí)間相關(guān)性，8 h后IFN-αmRNA表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；在 TLR7 siRNA沉默組，IFN-αmRNA的表達(dá)較RSV感染組的表達(dá)量顯著下降，8 h后降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11．46，P＜0．05）。見圖5。

2.6IFN-βm RNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)正常對照組的A549細(xì)胞的IFN-βmRNA表達(dá)基線很低；RSV感染組IFN-βmRNA的表達(dá)量升高且具有時(shí)間依賴性。RSV感染4 h后，IFN-βmRNA表達(dá)水平均高于正常對照組，各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；在TLR7 siRNA沉默組，經(jīng)TLR7 siRNA轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞表達(dá)IFN-βmRNA的量雖較正常對照組高，但與RSV感染組各時(shí)間點(diǎn)比較明顯下降，在轉(zhuǎn)染8 h后IFN-βmRNA的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11．72，P＜0．05）。見圖6。

2.7TLR7在各組不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白水平變化TLR7蛋白在正常A549細(xì)胞中表達(dá)非常低，經(jīng)RSV感染后，TLR7蛋白的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的增加，不斷上調(diào)（P＜0．01），RSV感染A549細(xì)胞后，不同感染時(shí)間點(diǎn)TLR7蛋白表達(dá)量均高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；在TLR7 siRNA沉默組，各時(shí)間點(diǎn)均檢測到TLR7蛋白表達(dá)量，但較RSV感染組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝26．90，P＜0．01）。見圖7。

2.8不同條件下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β水平的改變ELSIA法檢測A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-α／β的表達(dá)水平變化，RSV感染組IFN-α／β的表達(dá)量較正常對照組逐漸升高，具有時(shí)間依賴性。RSV感染組和正常對照組比較，感染的4 h后檢測到IFN-α／β表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），12 h后升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。在TLR7 siRNA沉默組，不同感染時(shí)間點(diǎn)IFN-β的表達(dá)量均低于RSV感染組，24 h后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝7．845，P＜0．05）。在各感染時(shí)間點(diǎn)TLR7 siRNA沉默組，IFN-α的表達(dá)量均低于RSV感染組，12 h后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6．181，P＜0．05），且IFN-α下降的更為明顯。見圖8。

3　討論

RSV是引起世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道感染最主要病原體之一，感染后可誘導(dǎo)宿主表達(dá)大量的細(xì)胞因子等生物活性介質(zhì)，導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)支氣管炎、肺炎、哮喘等疾病［6］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類進(jìn)化保守的模式識別受體，能識別和啟動不同病原體的相關(guān)模式分子，隨后誘導(dǎo)TLRs依賴的基因表達(dá)，通過級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而引起I 型IFN和促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，介導(dǎo)先天性免疫和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答來防御病毒的感染［7］。I型IFN中IFN-α和IFN-β是發(fā)揮早期抗病毒和調(diào)節(jié)免疫活性的主要效應(yīng)分子，IRF調(diào)控干擾素基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中 IRF7活化IFN-α啟動子，導(dǎo)致Ⅰ型IFN和其他細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，介導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答。但目前對RSV感染誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生及其在RSV致病中的作用仍不明確。已有研究［8-10］表明在RSV感染嬰幼兒的鼻咽洗液中檢測到I型IFN表達(dá)，IFN甚至可以引起免疫病理反應(yīng)。因此，探討TLR7活化在介導(dǎo)的Ⅰ型IFN的產(chǎn)生機(jī)制及其在RSV致病中的作用，具有非常重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，RSV感染A549細(xì)胞時(shí)可活化上調(diào)TLR7、IRF7、IFN-α／β的mRNA和TLR7的蛋白表達(dá)以及和培養(yǎng)上清液中IFN-α／β；在加入TLR7 siRNA后，TLR7、IRF7、IFN-α／β的表達(dá)較RSV感染組明顯下調(diào)，說明沉默TLR7后，下調(diào)了IRF7的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致IFN的產(chǎn)生減少，起到的抗病毒作用降低。當(dāng)A549細(xì)胞受到RSV感染時(shí)，TLR7識別病毒的ssRNA，主要通過級聯(lián)反應(yīng)將信號傳遞給IRF7，導(dǎo)致I型IFN的表達(dá)分泌，介導(dǎo)抗病毒作用。這與Davidson et al［11］在小鼠肺炎病毒感染BALB／c小鼠誘導(dǎo)急性肺炎的研究結(jié)果中TLR7的作用相一致。本課題組用TLR7 siRNA特異性沉默了TLR7的表達(dá)，研究其在RSV感染A549細(xì)胞中誘導(dǎo)I型IFN的抗病毒作用，更進(jìn)一步說明了TLR7的作用。

通過研究顯示，用TLR7 siRNA抑制了TLR7mRNA表達(dá)后，IFN-α／β的表達(dá)雖然均有下調(diào)，但I(xiàn)FN-α表達(dá)較IFN-β更顯著下調(diào)，表明由TLR7誘導(dǎo)產(chǎn)生的最主要I型IFN可能是IFN-α，且I型IFN的表達(dá)至少是部分依賴TLR7活化，TLR7可能為誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN抗病毒作用中的一個(gè)關(guān)鍵因素。進(jìn)一步研究TLR7在機(jī)體抗病毒感染中的作用，可為臨床治療RSV感染及研發(fā)抗RSV新藥提供重要思路。

參考文獻(xiàn)

［1］Wong TM，Boyapalle S，Sampayo V，et al．Respiratory syncytial virus（RSV）infection in eldly mice results in altered antiviral gene expression and enhanced pathology［J］．PLoSOne，2014，9 （2）：e88764．

［2］Nair H，Nokes D J，Gessner B D，et al．Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children：a systematic review and meta-analysis［J］．Lancet，2010，375（9725）：1545-55．

［3］Hall C B．Respiratory syncytial virus in young children［J］．Lancet，2010，375（9725）：1500-2．

［4］Lund JM，Alexopoulou L，Sato A，et al．Recognition of singlestranded RNA viruses by Toll-like receptor7［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（15）：5598-603．

［5］Crozat K，Beutler B．TLR7：A new sensor of viral infection［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2004，101（18）：6835-6．

［6］黃升海，劉偉，史曉佾，等．呼吸道合胞病毒感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)炎性基因表達(dá)的部分機(jī)制研究［J］．中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2009，25（10）：948-52．

［7］Meylan E，Tschopp J．Toll-like receptors and RNA helicases：two parallelways to trigger antiviral responses［J］．Mol Cell，2006，22（5）：561-9．

［8］Scagnolari C，Midulla F，Trombetti S，et al．Upregulation of interferon-induced genes in infants with virus-associated acute bronchiolitis［J］．Exp Biol Med（Maywood），2007，232（10）：1355 -9．

［9］Scagnolari C，Midulla F，Pierangeli A，et al．Gene expression of nucleic acid-sensing pattern recognition receptors in children hospitalized for respiratory syncytial virus-associated acute bronchiolitis［J］．Clin Vaccine Immunol，2009，16（6）：816-23．

［10］Welliver R C Sr．The immune response to respiratory syncytial virus infection：friend or foe？［J］．Clin Rev Allergy Immunol，2008，34（2）：163-73．

［11］Davidson S，Kaiko G，Loh Z，et al．Plasmacytoid dendritic cells promote host defense against acute pneumovirus infection via the TLR7-MyD88-dependent signaling pathway［J］．J Immunol，2011，186（10）：5938-48．

The role of TLR7 in A549 cellsw ith the respiratory syncytial virus infection induced type I interferon

He Hanwen1，Wang Cong2，Du Boyi2，et al
（1Dept of Microbiology，2School of Life Sciences，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveThis experimentwas designed to explore the antiviral effect of TLR7 when A549 cellswere infected by respiratory syncytial virus（RSV）to induce the production of type I interferon（IFN）．MethodsThis experimentwas divided into normal control group，RSV infection group and TLR7 silence group．In each group cell and culture supernatantwere collected after having been infected for 4，8，12 and 24 h．TLR7 siRNA was transfected in A549 cells by transient transfection．With the use of the RT-PCR assay，TLR7 gene silencing effect could be detected；with the use of Trizol reagent，the totalRNA could be extracted and the expression dynamicsofmRNA in TLR7，IRF7，IFN-αand IFN-βcould be detected；with the use of Western blot，protein expression could be tested；with the use of ELISA，the variation of IFNα／βin the culture supernatant of A549 cells infected in the different points of time could be detected．Results①24 h after transfection，TLR7 siRNA-2 could restrain the expression of TLR7 mRNA effectively with statistical significance．②The expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein，which existed time dependent relation with RSV infection，had increased after A549 cells had been infected by RSV．Meanwhile，compared with RSV infection group，the expression ofmRNA in TLR7，IRF7 and IFN-α／β，togetherwith TLR7 protein had decreased obviously in TLR7 silence group．③Compared with RSV infection group，the expression of IFN-α／βin cell culture supernatant and in TLR7 silent group had decreased，and the expression of IFN-αdecreased obviously．Itwentwithout saying that the difference of decrease in two groups had statistical significance．ConclusionAfter cell A549 have been infected by RSV，TLR7 could be activated and then induce type I interferon after having been infected by RSV，which play the role in anti-virus．Noticeably，IFN-αaccounts for themost of e type I interferon．

Key wordsrespiratory syncytial virus，A549 cells；Toll-like receptors 7；siRNA；Type I interferon

中圖分類號R 373．14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1560-06

基金項(xiàng)目：安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：KJ2012A152）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH129）；安徽省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（編號：AH201410366135）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室、2生命科學(xué)學(xué)院2012級生物技術(shù)專業(yè)，合肥230032

作者簡介：何漢文，男，碩士研究生；