甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對成年期甲減大鼠海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)及synaptotagm in-1表達(dá)的影響

查小雪，蔡瑤俊，吳章碧，吳　波，賈雪梅，朱德發(fā)

甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對成年期甲減大鼠海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)及synaptotagm in-1表達(dá)的影響

查小雪1，蔡瑤俊1，吳章碧1，吳波1，賈雪梅2，朱德發(fā)1

摘要目的觀察甲狀腺素（T4）聯(lián)合多奈哌齊（DON）治療對成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）大鼠海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)及突觸結(jié)合蛋白synaptotagmin-1（syt-1）表達(dá)的影響。方法飲0．05%丙基硫氧嘧啶（PTU）水建立成年期大鼠甲減模型共6周，第5周起，T4治療組給予腹腔注射T4 6μg／100 g體重、DON治療組飲0．005%DON水，聯(lián)合治療組給予T4 ＋DON治療，對照組及甲減組每日腹腔注射等量生理鹽水。采用放射免疫法測定血清甲狀腺素水平，透射電鏡觀察海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，Western blot方法分析海馬內(nèi)syt-1的表達(dá)水平。結(jié)果甲減組、DON治療組大鼠血清甲狀腺激素水平明顯降低（P＜0．01），T4治療組、聯(lián)合治療組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；電鏡下甲減大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元中線粒體呈現(xiàn)明顯空泡變性、游離核糖體稀疏、突觸結(jié)構(gòu)受損、突觸小泡數(shù)量減少，T4或DON治療后上述損傷有所改善，而聯(lián)合治療恢復(fù)后表現(xiàn)最接近對照組；甲減大鼠海馬內(nèi)syt-1蛋白表達(dá)量明顯降低（P＜0．01），單獨(dú)T4或DON治療后表達(dá)仍下降（P＜ 0．05），聯(lián)合治療后syt-1表達(dá)恢復(fù)正常。結(jié)論成年期甲減可致大鼠海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)發(fā)生病理學(xué)損害，syt-1蛋白表達(dá)下降，T4＋DON治療有利于上述損傷的修復(fù)，作用優(yōu)于單一藥物治療。

關(guān)鍵詞甲狀腺功能減退癥；海馬；超微結(jié)構(gòu)；synaptotagmin-1；甲狀腺素；多奈哌齊

2015-05-06接收

2安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)室，合肥230022

朱德發(fā)，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zdfa0168 ＠sina．com

成年期甲狀腺功能減退癥（簡稱甲減）可引起一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的損害［1］。海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與認(rèn)知、情感等功能密切相關(guān)的區(qū)域，其神經(jīng)元是甲狀腺素作用的靶點(diǎn)［2］。成年期甲減可導(dǎo)致海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的損害［3］，其機(jī)制可能涉及神經(jīng)元間聯(lián)系和突觸可塑性，是多種突觸蛋白參與的復(fù)雜生理過程。Synaptotagmin-1（syt-1）是突觸囊泡包膜蛋白，在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)豐富，主要分布于小突觸囊泡和大致密囊泡表面，通過調(diào)控突觸囊泡的循環(huán)再利用參與突觸傳遞的全過程，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)［4］。以往的研究［5］表明成年期甲減能導(dǎo)致syt-1蛋白在海馬內(nèi)表達(dá)下降，然而給予生理劑量甲狀腺素（thyroxine，T4）替代治療至血清甲狀腺激素水平正常后，syt-1蛋白的表達(dá)卻未能完全恢復(fù)。多奈哌齊（donepezil，DON）是一種膽堿酯酶抑制劑，能有效改善認(rèn)知和記憶障礙［6］，對于甲減引起的海馬損害可能也具有一定的治療效果。該研究采用飲丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）水制備甲減大鼠模型，觀察大鼠海馬內(nèi)超微結(jié)構(gòu)及syt-1蛋白表達(dá)的情況，并評價(jià)LT4聯(lián)合DON的治療效果。

1　材料與方法

1．1主要試劑PTU、四碘甲狀腺原氨酸（tetraiodothyronine，T4）、DON（美國Sigma公司）；三碘原氨酸（triiodothyronine，T3）、T4放射免疫試劑盒（北方生物技術(shù)研究所）；兔抗大鼠抗syt-1蛋白多克隆抗體、兔抗大鼠抗GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋有限公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）。

1．2動物模型復(fù)制健康雄性SD大鼠40只，3月齡，SPF級，230～260 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。所有大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，溫度21～23℃，濕度（50±5）%，晝夜均衡。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將SD大鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組（CON組）、甲減組（Hypo組）、甲狀腺素治療組（T4組）、多奈哌齊治療組（DON組）、甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊治療組（T4＋DON組），每組8只。造模總時(shí)間6周，CON組飲用正常水，其他 4組每天飲用0．05%PTU水［3］。4周后，T4組開始腹腔注射T4（溶解在生理鹽水中，6μg／100 g體重），DON組在飲用水中加0．005%DON，T4＋DON組既飲用0．005%DON也腹腔注射T4。同時(shí)，余下3組大鼠以等量生理鹽水替代注射。治療時(shí)間共2周，各組大鼠根據(jù)每周稱量的體重結(jié)果，調(diào)整給藥劑量。

1．3標(biāo)本制備稱量5組大鼠體重，給予水合氯醛（0．3 ml／100 g體重）腹腔注射，麻醉后打開腹腔，腹主動脈取血待測血清T3、T4水平。取血后將大鼠取腦，冰上迅速分離背側(cè)海馬組織，左側(cè)海馬放于4%多聚甲醛溶液待做透射電鏡觀察，右側(cè)海馬置于-80℃冰箱待做Western blot實(shí)驗(yàn)。

1．4甲狀腺激素水平測定采用放射免疫法進(jìn)行大鼠血清T3、T4水平測定。

1．5電鏡觀察將組織切成1 mm3小塊，2．5%戊二醛4℃固定4～6 h后，再以l%鋨酸固定1 h，經(jīng)乙醇脫水，環(huán)氧樹脂（Epon812）包埋，進(jìn)行超薄切片，在醋酸鈾及枸櫞酸鉛溶液中浸泡染色，常規(guī)沖洗后，用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)并射片。

1.6Western blot法分析取背側(cè)海馬組織置于玻璃勻漿器，加入RIPA裂解液和PMSF，冰上勻漿，提取總蛋白。4℃、15 000 r／min離心15 min，吸取上清液。用Lorry法測定總蛋白濃度，定量后向樣品中加入2×上樣緩沖液（1∶1），98℃10 min將蛋白變性處理，分裝，-80℃凍存。各組取20μg樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2．5 h，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉過夜。次日加入一抗syt-1 （1∶1 000）及GAPDH（1∶4 000）孵育2 h，0．05% PBST溶液洗膜3次，每次10 min，洗滌后用HRP標(biāo)記的IgG二抗（1∶100 000）室溫孵育1～2 h，再用0．05%PBST溶液洗膜，最后加入ECL增強(qiáng)發(fā)光液，在Fine-do X6顯影儀（上海天能公司）下拍攝，以GAPDH作為內(nèi)參對照，計(jì)算目的蛋白與GAPDH的相對光密度比值。

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩間比較采用LSD法檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以±s表示。

2　結(jié)果

2．1大鼠體重和血清甲狀腺素水平各組大鼠造模前體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模結(jié)束后，CON組體重增加了93．0%，而Hypo組、T4組、DON組、T4＋DON組與造模前相比體重分別增加38．6%、63．2%、35．6%、63．6%，與CON組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝156．215，P＜0．01）。在血清放射免疫試驗(yàn)中，與CON組相比，Hypo組及DON組T3、T4水平顯著減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝15．236、357．516，P＜0．01）；T4組及聯(lián)合治療組大鼠血清T3、T4水平接近正常水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1　各組大鼠體重及血清激素值比較（n＝8，±s）

表1　各組大鼠體重及血清激素值比較（n＝8，±s）

與CON組比較：**P＜0．01

組別　　體重（g）T3（nmol／L）　T4（nmol／L）造模前　　造模后CON　231．25±9．54　446．25±11．10　0．35±0．07　76．19±6．07 Hypo　233．12±7．99　323．12±18．53**0．19±0．05**21．75±2．50**T4　231．25±7．44　377．38±7．78**　0．36±0．05　75．03±4．95 DON　230．62±11．78　312．75±11．64**0．18±0．07**20．58±2．73**T4＋DON　233．75±2．31　382．38±8．48**0．37±0．10　74．50±4．81

2．2電鏡觀察

2．2．1神經(jīng)元變化CON組神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞核核膜光滑完整，染色質(zhì)分布均勻；線粒體發(fā)達(dá)、內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)清晰；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體豐富（圖1A）。Hypo組神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞核染色質(zhì)邊集；大量線粒體腫脹，嵴斷裂，內(nèi)膜面積減少，呈現(xiàn)顯著空泡樣變性；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體明顯稀疏（圖1B）。T4組、DON組神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞核核膜清晰，而細(xì)胞器較稀疏，少量線粒體內(nèi)空泡形成，部分粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張（圖1C、D）。T4＋DON組神經(jīng)元內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及核糖體形態(tài)與CON組基本相似（圖1E）。

2．2．2突觸變化CON組突觸前膜、突觸間隙、突觸后膜3層結(jié)構(gòu)清晰，特化帶明顯，突觸小泡豐富，可見清亮型和致密芯型小泡（圖2A）。Hypo組突觸前、后膜融合，突觸小泡明顯減少，幾乎不見清亮型（圖2B）。T4組、DON組突觸前、后膜模糊，突觸間隙較清晰，突觸小泡清亮型數(shù)量減少（圖2C、2D）。T4＋DON組突觸三層結(jié)構(gòu)較清晰，突觸小泡較豐富，接近CON組（圖2E）。

2.3大鼠海馬syt-1蛋白表達(dá)的變化與CON組比較，syt-1蛋白在Hypo組海馬內(nèi)表達(dá)顯著減少，為CON組的48．4%（P＜0．01）。在T4組和DON組，降低的syt-1蛋白表達(dá)量比Hypo組有所恢復(fù)，但與CON組比較仍有差異，分別為CON組的80．1%（P ＜0．05）、69．9%（P＜0．01）。T4＋DON組大鼠海馬內(nèi)syt-1蛋白表達(dá)量為CON組的98．9%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3　討論

海馬容易在成年階段受到甲減的損害，本實(shí)驗(yàn)在形態(tài)學(xué)發(fā)現(xiàn)成年期甲減大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損害。透射電鏡下神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體呈現(xiàn)腫脹、空泡變性，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，游離核糖體明顯稀疏。David et al［7］發(fā)現(xiàn)甲減大鼠神經(jīng)元內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和線粒體形態(tài)都有改變，核糖體數(shù)目減少，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另外，本研究還觀察到突觸出現(xiàn)特化帶融合，結(jié)構(gòu)不清晰，突觸小泡減少的形態(tài)改變。Cortes et al［8］的研究結(jié)果表明成年甲減大鼠腦中出現(xiàn)多系統(tǒng)的神經(jīng)元突觸后變化，突觸后密度減少。也有實(shí)驗(yàn)報(bào)道甲減導(dǎo)致神經(jīng)元樹突狀超微結(jié)構(gòu)的退化［9］。眾所周知，線粒體和核糖體是能量和蛋白質(zhì)合成的活性位點(diǎn)［10］，突觸作為神經(jīng)元之間信息傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，上述神經(jīng)元內(nèi)細(xì)胞器、突觸超微結(jié)構(gòu)的破壞可能會引起能量代謝的障礙，進(jìn)而影響相關(guān)腦區(qū)蛋白的合成。

syt-1是一種分子量為65ku的突觸小體蛋白，其作為快速Ca2＋感受器，促進(jìn)突觸小泡的融合，在神經(jīng)遞質(zhì)同步釋放調(diào)控過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Western blot方法測定的結(jié)果顯示，與對照組相比，甲減組syt-1蛋白表達(dá)量明顯減少。Wang et al［11］發(fā)現(xiàn)在碘缺乏和甲減大鼠的小腦中，syt-1蛋白表達(dá)下調(diào)，本研究結(jié)果與之一致，然而其受損機(jī)制仍未明確。研究［12］顯示T4可以調(diào)節(jié)腦中蛋白質(zhì)的合成，T4缺乏直接導(dǎo)致海馬中甲狀腺素受體表達(dá)下調(diào)并影響其作用的靶蛋白的表達(dá)，甲減時(shí)syt-1蛋白表達(dá)減少可能與此有關(guān)。

T4替代治療是目前國際上公認(rèn)的治療甲減的標(biāo)準(zhǔn)方案。本實(shí)驗(yàn)中成年期甲減大鼠在給予常規(guī)劑量的T4治療2周后，海馬內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞器、突觸超微結(jié)構(gòu)的損傷及syt-1蛋白的表達(dá)部分恢復(fù)，但未達(dá)到正常水平。研究［13］顯示，即使6周的T4替代治療也未能使表達(dá)減少的PKCγ蛋白恢復(fù)正常。上述均說明，在T4替代治療到血清甲狀腺激素恢復(fù)正常時(shí)，甲減引起的腦中分子障礙可能并沒有完全恢復(fù)。研究［14］表明，血清甲狀腺激素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的濃度。T4治療后海馬損傷未完全治愈的現(xiàn)象，可能與血清甲狀腺激素水平恢復(fù)正常時(shí)，腦內(nèi)劑量仍然不足有關(guān)。研究［5］表明，當(dāng)給予成年期甲減大鼠大劑量T4（20μg／100 g體重）沖擊治療時(shí)，海馬內(nèi)syt-1表達(dá)可恢復(fù)到正常水平，但同時(shí)血清T3、T4水平超過正常高值，有誘發(fā)甲亢的風(fēng)險(xiǎn)。

T4聯(lián)合DON治療后，甲減大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體形態(tài)與數(shù)量基本恢復(fù)，突觸結(jié)構(gòu)清晰、突觸小泡數(shù)量豐富，突觸小體內(nèi)syt-1的表達(dá)量達(dá)到正常水平，說明DON能改善甲減引起的海馬損傷。DON作為膽堿酯酶抑制劑，通過與膽堿酯酶結(jié)合，阻止腦中乙酰膽堿的水解，臨床上主要用來治療輕中度認(rèn)知功能障礙，具有獨(dú)立的神經(jīng)保護(hù)作用。DON被報(bào)道可以改善菌素引發(fā)的神經(jīng)元線粒體功能障礙［15］；維護(hù)老齡大鼠椎體神經(jīng)元的樹突狀分支、增加總樹突長度和突觸后密度［16］。上述結(jié)果均提示DON可以通過改善海馬內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞器、突觸病變結(jié)構(gòu)而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。此外，有研究［17］顯示DON可以通過誘導(dǎo)乙酰膽堿的抗炎作用來改善tau病鼠海馬中突觸蛋白的表達(dá)；本課題組先前的免疫組織化學(xué)方法研究［3］發(fā)現(xiàn)，DON對甲減引起的突觸蛋白munc18、syntaxin-1的損傷有益。這些突觸蛋白的恢復(fù)可能也正是多奈哌齊發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的體現(xiàn)。

綜上所述，成年期甲減可造成大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞器、突觸超微結(jié)構(gòu)的損傷及突觸小體內(nèi)syt-1蛋白的表達(dá)減少，上述變化可以通過T4替代治療得到部分恢復(fù)，T4聯(lián)合DON治療使甲減導(dǎo)致的改變恢復(fù)至正常，比單獨(dú)應(yīng)用T4治療更有效。

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Effects of thyroxine and donepezil on hippocampal ultrastructure and synaptotagm in-1 expression in hypothyroid adult rats

Zha Xiaoxue，Cai Yaojun，Wu Zhangbi，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate the effectof thyroxine（T4）and donepezil（DON）treatmenton the hypothyroidism-induced alterations of ultrastructure and synaptotagmin-1（syt-1）expression in the hippocampus of adult rats．MethodsAdministration of 0．05%propylthiouracil（PTU）to drinking water for 6 weeks was used to replicate themodel of hypothyroidism．From the5th week，T4 group was given thyroxine（6μg／100 g bodyweight）by intraperitoneal injection，DON group was given 0．005%DON in the drinking water，T4＋DON group was given a combination of both，the control and hypothyroid groupswere given the same volume of saline solution by intraperitoneal injection daily．The concentration of serum T3 and T4 was determined by radioimmunoassay kits，and the hippocampal ultrastructure was observed with transmission electronmicroscope（TEM）and the protein level of syt-1 wasmeasured by Western blot．ResultsCompared to the control group，the concentration of serum T3 and T4 was significantly decreased in the hypothyroid group and the DON group（P＜0．01），but returned to the normal in the T4 group or combined with DON group．TEM revealed that signficant degeneration was in mitochondria and rarefaction in free ribosomes ofadulthpothyroid rats，synaptic structural damage and reduction ofsynaptic vesicles also appeared．The ultrastructuralwas partly restored by T4 or DON administration，but was completely restored by a combination of both treatments．Expression of syt-1 protein was significantly lower in hypothyroid rats compared with the controls（P＜0．01），and was still expressed at lower level in hypothyroid treated with T4 alone（P＜0．05），whilewas restored to normal values after co-administation of T4 and DON．ConclusionThese observations indicate that adult hypothyroidism induces ultrastructural damage and a decrease of syt-1 proten in the hippocampus，and the alterations can not be restored by T4 monotherapy．In addition，the co-administration of T4 and DON result in more effective restoration than either alone．

Key wordshypothyroidism；hippocampus；synaptotagmin-1；ultrastructure；thyroxine；donepezil

中圖分類號R 581．2；R 322．81；R 446．6-3；R 977．14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1547-05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81272152）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科，合肥230022

作者簡介：查小雪，女，碩士研究生；