奶牛復方促孕灌注液的安全性和穩定性試驗研究

廉宜君，陳韓英，李炳奇，谷新利*

（1.石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學藥學院；3.石河子大學動物科技學院）

奶牛復方促孕灌注液的安全性和穩定性試驗研究

廉宜君1，陳韓英2，李炳奇1，谷新利3*

（1.石河子大學化學化工學院，新疆 石河子 832000；2.石河子大學藥學院；3.石河子大學動物科技學院）

為了解奶牛復方促孕灌注液的安全性和穩定性，采用急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗對促孕灌注液進行安全性評價，并采用強光照射試驗、高濕度試驗、加速試驗和室溫留樣觀察試驗考察其穩定性。結果表明，制備的灌注液屬無毒、無刺激藥物，并且穩定性良好。

促孕灌注液；安全性；穩定性

石河子大學動物科技學院針對奶牛不孕現狀，研制開發了中藥復方“促孕散”，該方由淫羊藿、益母草等九味中藥，依辨證論治療原理配制而成，主要用于治療母畜卵巢靜止和持久黃體引起的不孕癥，臨床效果顯著[1]。以“促孕散”為基礎制備的灌注液，有效成分利用率高，臨床用藥量明顯減少，且操作方便。最明顯的優勢是藥液質量可控，改變了用藥途徑，使藥物直達患處，能直接對病癥進行治療。

藥物毒性反應的危害是國際社會共同關注的問題。長期以來，人們普遍認為，純中藥制劑毒性很小甚至無毒，但近年來有關中藥的不良反應時有報道，特別是某些注射用中藥致人死亡事件的發生令人擔憂，使人們開始重新審視中藥的安全性，而對中藥及其制劑用于防治疾病時，必須進行毒性試驗，同時藥物的安全性試驗數據也是新藥審批的必備材料[2]。該灌注液為經奶牛子宮灌注的黏膜類用藥，也必須符合黏膜類藥物的相關要求。

本研究通過采用急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗，并采用加速試驗及室溫留樣考查試驗等方法考察其安全性和穩定性，為該制劑用于獸醫臨床治療奶牛不孕癥提供安全性和穩定性的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

奶牛復方促孕灌注液（自制），昆明種成年雌性小白鼠（石河子大學實驗動物中心提供），雌性新西蘭兔（由石河子大學實驗動物中心提供，平均體重為1.9～2.3 kg），飼養于恒溫（23±3）℃動物房內，動物房通風良好，光照12 h，濕度50%～60%，每天上、下午各排氣1次，每次30 min以上。

1.2 試驗方法

1.2.1 促孕灌注液安全性檢驗

1.2.1.1 試驗前動物處理

試驗動物購回后，先預飼1周，使其適應新環境。預飼期間，保持動物生活環境的清潔，提供充足的食物及飲水，并仔細觀察其活動情況，若發現有行為異常及生病情況的，應及時挑出，以免影響試驗結果。

1.2.1.2 急性毒性試驗

取健康小白鼠30只，隨機分為3組，用藥前12 h禁食不禁水，腹腔注射量分別是：第1組0.5 mL/10 g體重，第2組0.25mL/10 g體重，第3組0.125 mL/10 g體重。同時設不給藥對照組。給藥后常規飼養，觀察3 d內小白鼠死亡情況，計算LD50[3]。

3 d內若有死亡，應立即進行尸檢；試驗結束時也應進行尸檢，觀察其內臟器官的變化情況。

1.2.1.3 蓄積毒性試驗

取健康小白鼠30只，體重約20 g，隨機分為3組，給藥前12 h禁食不禁水，給藥量分別是：第1組0.1 mL/只，第2組0.2 mL/只，第3組0.3 mL/只。同時設不給藥對照組。給藥后常規飼養，連續給藥20 d，在給藥期間每天觀察小白鼠的生理狀態和活動情況（包括精神狀況和飲食狀況等）。給藥結束后再觀察1周，并剖殺尸檢，觀察其內臟組織器官有無異常[4]。

1.2.1.4 刺激性試驗

選取正常健康家兔6只，采用同體自身對照，用藥前先觀察并記錄角膜、虹膜及結膜情況，剔除有病變或炎癥者。試驗時在左眼結膜囊內滴入0.l mL生理鹽水，右眼滴入0.1 mL的促孕灌注液，然后使其被動閉合眼睛8～10 s，觀察給予藥物1 h、24 h、48 h，72 h后眼睛的反應情況，并按表1進行評分[5]。

表1 眼刺激反應評分標準

1.2.2 促孕灌注液穩定性檢驗

參照文獻[6]中2010年版附錄藥物穩定性試驗指導原則確立了穩定性研究考察項目，檢測指標為外觀與色澤、微生物限度及pH值。

1.2.2.1 強光照射試驗

將促孕灌注液放入自制木箱，接上100W白熾燈全天照射灌注液，按時取樣觀察并測定相關指標[7]，取樣時間為：0天（當天）、第5天、第10天。各測定項以0天為參照。

1.2.2.2 高濕度試驗

在干燥器下部放置KNO3溶液，使其達到溫度25℃，相對濕度（90±5）%的條件，再將灌注液放入干燥器內按時取樣觀察并測定相關指標，取樣時間為：0天（當天）、第5天、第10天。各測定項以0天為參照。

1.2.2.3 加速試驗

將促孕灌注液在溫度（40±2）℃、相對濕度（60 ±5）%的條件下放置3個月，試驗期間每個月取樣觀察并測定相關指標。各測定項以0天為參照。

1.2.2.4 室溫留樣觀察試驗

取促孕灌注液樣品，在室溫下放置12個月。每隔3個月取樣觀測其外觀色澤、澄清度、測定pH值。各測定項以0天為參照。

2 結果與分析

2.1 急性毒性試驗結果

小白鼠注射藥物后2 h內有輕微不適，食欲減退，飲水量正常；注射藥物4～6 h，小白鼠活動恢復正常，未見任何異常反應；7 d內無小白鼠死亡。斷頸處死后解剖觀察小白鼠內臟，均無異常。本試驗小白鼠注射灌注液量相當于生藥量500 g/kg體重，LD50遠遠大于15 g/kg體重毒理學評價標準。證明該促孕灌注液屬無毒類物質。

2.2 蓄積毒性試驗結果

3組小白鼠分別按 0.1 mL/只，0.2 mL/只，0.3 mL/只給藥20 d，在給藥期間和停藥后7 d內，小白鼠無死亡現象，也無異常反應。給藥結束后再觀察1周，并剖殺稱重尸檢，各試驗組小白鼠體重與對照組無顯著性差異，觀察其內臟組織器官均健康無異常。說明該促孕灌注液基本上無蓄積毒性。

2.3 刺激性試驗結果

在給家兔右眼滴入促孕灌注液6 h后，6只家兔出現不同程度的眼結膜血管充血現象，并有少量分泌物，無水腫癥狀，表明該灌注液具有較弱的刺激作用，而隨著時間的推移，其刺激作用越來越弱，24 h后充血現象逐漸減弱，48 h后充血現象基本消失，除個別有少量分泌物外，角膜、虹膜在滴入藥液后無任何癥狀出現，綜合評分為3分，按藥理學實驗標準判定為無刺激性藥物。表明該促孕灌注液是一種符合黏膜用藥的制劑。

2.4 強光照射試驗結果

促孕灌注液強光照射試驗結果見表2。由表2可知，促孕灌注液在100 W強光照射的條件下放置10 d，物理性狀沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，藥液氣味芳香，pH值基本不變。

表2 強光條件下促孕灌注液的檢測結果

2.5 高濕度條件下的試驗結果

促孕灌注液高濕度條件下的試驗結果見表3。由表3可以看出，促孕灌注液在溫度25℃，相對濕度（90±5）%的條件下，物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，無任何雜質，氣味芳香，pH值基本不變。

表3 高濕度條件下促孕灌注液的檢測結果

2.6 加速試驗結果

促孕灌注液加速試驗結果見表4。由表4可以看出，在溫度40℃，相對濕度75%的條件下觀察5個月，從每月的取樣觀察、測定結果可知該促孕灌注液的物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，澄清無沉淀，氣味芳香，pH值基本不變。

表4 加速試驗條件下灌注液的檢測結果

2.7 室溫留樣觀察試驗結果

該灌注液經12個月室溫留樣考察，藥液均無異常現象，物理性狀幾乎沒有改變，外觀仍為棕色的清亮液體，無雜質，pH值保持在6.6～6.8，藥物穩定，結果與加速試驗基本一致，故認為本灌注液基本能保證藥品的質量，因此有效期可暫定1年。

3 討論

（1）中藥毒性可以被理解為中藥不良反應。本試驗從急性毒性試驗、蓄積毒性試驗、刺激性試驗幾個方面，對灌注液進行了安全性評價。從試驗結果可以看出，LD50遠遠大于15.00g/kg體重，根據獸藥安全評價標準，當LD50＞15g/kg體重時，藥物屬于無毒性物質，所以該灌注液屬無毒類藥物。（2）在蓄積毒性試驗中，給小白鼠連續給藥20 d，未出現死亡，在停藥1周內，小白鼠仍未出現死亡，證實了灌注液無蓄積毒性。給藥組小鼠在灌胃后短時間內出現輕度腹瀉，糞便稀軟的現象，分析可能是藥物濃度較高，灌藥量較大對胃腸等器官造成較大壓迫作用，致使胃腸蠕動興奮。（3）該促孕灌注液經奶牛子宮灌注，必須保證藥物對奶牛子宮用藥的安全性，從刺激性試驗結果可知，其符合黏膜類藥物的制劑要求，為該藥液的臨床應用奠定了基礎。（4）從穩定性試驗可知，促孕灌注液在100W強光照射的條件下放置10d或在相對濕度（90 ±5）%的環境中或在5個月的加速試驗期內穩定，該促孕灌注液的物理性狀幾乎沒有改變，外觀均為棕色的清亮液體，澄清無沉淀，氣味芳香，pH值基本不變。該灌注液經12個月室溫留樣考察，各項指標均無明顯改變，藥物穩定。有效期可暫定1年。

[1]羅瑞卿，谷新利.促孕散治療奶牛卵巢疾病引起不孕癥的研究[J].石河子大學學報（自然科學版），2009，27（4）：455-457.

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2000版）二部[M].北京：農業出版社，2000.

[3]陳奇.中藥藥理研究方法學[M].北京：人民衛生出版社，1996.

[4]徐叔云，卞如濂，陳修，等.藥理實驗方法學[M].北京：人民衛生出版社，2002.

[5]引乾，羅延紅，蒿彩菊，等.藥理學實驗指導[M].陜西楊凌：西北農林科技大學出版社，1998.

[6]國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：化學工業出版社，2010.

[7]辛蕊華，謝家聲，鄭繼方，等.射干地龍顆粒的含量測定及制劑穩定性研究[J].中國畜牧獸醫，2013，40（7）：29-33.

新疆以工代賑示范工程獲中央投資1.04億元

6月2日，新疆維吾爾自治區發改委在網站公布，近日，國家發展改革委下達了我區以工代賑示范工程2015年中央預算內投資計劃，安排資金1.04億元，創近年來新高。

此次計劃主要安排在和田、喀什、克州等7個地州的英吉沙、洛浦、莎車、塔什庫爾干、尼勒克、托里、青河等21個縣。重點支持跨區域、綜合性示范效果和帶動作用強的田間水渠配套、小流域治理、草場建設、中低產田改造、斷頭連接路等基礎性工程。

以工代賑示范工程是國家在貧困地區實施的，對調整當地產業結構和增加農牧民收入具有典型示范帶動效益的項目。自1984年至今，已是我區實施以工代賑項目第31個年頭。

（《新疆都市報》）

2015—05—06

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：谷新利，男，漢族，教授，博士，博士生導師。