貴州省豬源沙門氏菌Ⅰ類整合子與耐藥基因盒研究

王源　譚艾娟　呂世明等

摘要： 為了調查規模養殖場沙門氏菌中Ⅰ類整合子的流行情況，采用聚合酶鏈式反應檢測了從貴州省規模養豬場分離的57株沙門氏菌中Ⅰ類整合子的攜帶率以及整合子中耐藥基因盒的種類；采用微量肉湯稀釋法測定了57株沙門氏菌對12種抗菌藥物的敏感性；并應用χ2檢驗檢測Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株耐藥性的相關性。結果顯示，57株沙門氏菌中Ⅰ類整合子檢出率為40.4%（23/57）；耐藥基因盒檢出率為31.6%（18/57）；整合子中攜帶可分別介導對氨基糖苷類和磺胺類藥物耐藥的aadA2、aadA5、aadA22、aadA23b、dfrA1、dfrA12和dfrA17基因；57株沙門氏菌對12種抗菌藥物的耐藥率不同，Ⅰ類整合子與多重耐藥之間有明顯的相關性。

關鍵詞：沙門氏菌；Ⅰ類整合子； 基因盒； 耐藥性； 多重耐藥

中圖分類號：S852.61 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0105-04

Abstract To investigate the prevalence state of classⅠintegron in Salmonella， the carrying rates of classⅠintegrons and the types of drug resistance gene cassettes of 57 Salmonella strains isolated from scale swine farms were determined by polymerase chain reaction （PCR）. The susceptibility of the Salmonella strains to 12 antimicrobial was tested by the broth dilution method. The correlation of anti-microbial resistance between the positive and negative strains of classⅠintegron was analyzed by χ2 test. The results showed that the carrying rate of classⅠintegrons and drug resistance gene cassettes was 40.4% （23/57） and 31.6% （18/57） respectively. The genes of aadA2， aadA5， aadA22， aadA23b， dfrA1， dfrA12 and dfrA17 were checked out in classⅠintegrons， which mediated Salmonella resistance to aminoglycoside antibiotics and sulfa drug resistance respectively. Fifty seven strains of Salmonella had different drug resistance rates to 12 antimicrobial. The gene cassette carried in classⅠintegron presented obvious relativity to multi-drug-resistance （MDR）.

Key words Salmonella； Integron classⅠ； Gene cassette； Drug resistance； Multi-drug-resistance

沙門氏菌（Salmonella）是危害人和動物健康的重要致病菌之一，嚴重威脅養殖業和食品安全[1]。抗菌藥物的廣泛使用，尤其是不規范使用，導致耐藥現象日益嚴重[2]。整合子是介導細菌耐藥性的主要機制之一[3]，整合子作為可移動的基因元件，在整合酶的作用下，可通過位點特異的重組系統捕獲外源性的基因盒并使之表達；同時整合子可定位于質粒上，或者自身作為轉座子的一部分參與轉移，使耐藥基因在細菌種間和種內傳播[4]。整合子中絕大多數已知基因盒攜帶的是抗生素抗性基因，已確認的有70多個抗性基因盒[5]。目前，對整合子的研究多集中在臨床菌株[6]，對豬源沙門氏菌的報道較少。本研究從貴州省規模養豬場分離到57株沙門氏菌，對其Ⅰ類整合子及攜帶的耐藥基因盒進行了檢測，并進行了藥敏試驗，應用χ2檢驗分析了Ⅰ類整合子陽性菌株與陰性菌株耐藥表型的相關性，對于監測細菌耐藥性的傳播具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

緩沖蛋白胨水肉湯（BPW）、TTB肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽酸鈉瓊脂（XLD）、營養瓊脂、米勒-海頓肉湯（MHB）均購自杭州博微生物技術有限公司；阿莫西林、氨芐西林、大觀霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、土霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、復方新諾明、多粘菌素E、慶大霉素和磺胺甲基異惡唑原料藥購自上海博微科技有限公司。Ex Taq酶試劑盒購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自天根生物公司；質粒小提試劑盒及T-A克隆試劑盒購自TaKaRa公司。

57株豬源沙門氏菌均分離于貴州各地區規模養殖場中，標準質控菌株大腸埃希菌（ATCC25922）購自微生物保藏中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA模板的制備 沙門氏菌經選擇性培養基培養后挑取單菌落采用煮沸法提取總DNA。

1.2.2 Ⅰ類整合子檢測 根據Ⅰ類整合子的整合酶基因序列，參照文獻[7]設計引物（表1）。

50 μL PCR反應條件見表2，PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。endprint

1.2.3 Ⅰ類整合子基因盒檢測 參照文獻[7]設計Ⅰ類整合子基因盒可變區通用引物，上游：5′-GGCATCCAAGCAGCAAGC-3′，下游：5′-AAGCAGACTTGACCTGAT-3′。50 μL PCR反應條件如表3，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.4 基因盒擴增產物測序及序列分析 應用天根生化科技有限公司膠回收試劑盒回收Ⅰ類整合子可變區基因盒擴增產物，將膠回收產物連接pMD18-T載體。連接產物轉化DH5α感受態細胞，經PCR鑒定，選取陽性菌株提取質粒，送上海生工生物技術股份有限公司進行測序。得到的序列進行Blast比對，確定Ⅰ類整合子可變區基因盒所含耐藥基因的種類。

1.2.5 藥物敏感性試驗 參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準，采用微量肉湯稀釋法測定57株沙門氏菌對12種抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）；并按中國獸醫藥品監察所標準進行耐藥性統計。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌Ⅰ類整合子檢測結果

部分沙門氏菌Ⅰ類整合子intI1基因PCR擴增結果見圖1。57株豬源性沙門氏菌中，共有23株得到303 bp的擴增產物。陽性菌株再經Ⅰ類整合子3′末端保守序列sul1基因檢測，23株菌株均擴增出了大小為416 bp的目的條帶（圖2）。說明23株豬源沙門氏菌均含有Ⅰ類整合子，檢出率為40.4%（23/57）。

2.2 Ⅰ類整合子耐藥基因盒檢測結果

單株沙門氏菌可擴增出0～2個數目不等的條帶。其中，有3株沙門氏菌擴增出2個大小不同的條帶，分別為1 kb與1.7 kb和1.7 kb與2.0 kb，攜帶率為13.04%（3/23）；有15株沙門氏菌擴增出1個條帶，分別為1、1.2、1.7 kb和2.0 kb左右，攜帶率65.22%（15/23）；5株沙門氏菌沒有擴增出條帶，說明其Ⅰ類整合子不含基因盒。

2.3 Ⅰ類整合子耐藥基因盒序列分析

基因盒陽性菌株質粒提取物測序結果顯示，1 kb左右的條帶，含2種耐藥基因：aadA22和aadA23b，編碼氨基糖苷核苷轉移酶，與大觀霉素耐藥有關；1.2 kb大小的片段，包含一個耐藥基因dfrA1，編碼二氫葉酸合成酶，與甲氧芐啶耐藥有關；1.7 kb大小的片段，含有2個耐藥基因dfrA17和aadA5，編碼二氫葉酸合成酶和氨基糖苷核苷轉移酶，與甲氧芐啶和大觀霉素耐藥有關；2.0 kb大小的片段，含有dfrA12、aadA2和orfF，編碼二氫葉酸合成酶和氨基糖苷核苷轉移酶，與甲氧芐啶和大觀霉素耐藥有關，其中orfF為功能未知基因（表4）。

由表4可知，基因盒中所含耐藥基因以氨基糖苷類耐藥基因出現頻率最高，為28.07%（16/57），沒有檢測到β-內酰胺類、四環素類、喹諾酮類、氯霉素類、多肽類藥物耐藥基因。

氨基糖苷類藥物耐藥基因以aadA5出現頻率最高，其次為aadA2、aadA22與aadA23b。磺胺類藥物耐藥基因以dfrA17出現頻率最高，其次為dfrA12和dfrA1（表5）。

57株沙門氏菌對12種常用抗菌藥物存在不同程度的耐藥性，特別是對四環素類的耐藥性最嚴重，耐藥率高達100%；對多肽類的耐藥率則相對較低，為22.8%。根據Ⅰ類整合子檢測結果，將57株菌分為Ⅰ類整合子陽性菌組與陰性菌組，對12種抗菌藥物耐藥率進行χ2檢驗，結果顯示，頭孢噻呋鈉、磺胺異惡唑、復方新諾明、慶大霉素、大觀霉素在整合子陽性組的耐藥率極顯著或顯著高于整合子陰性組（P<0.01或P<0.05，表6）。

3 結論與討論

本研究從分離得到的57株沙門氏菌中檢測出23株攜帶有Ⅰ類整合子，檢出率為40.4%（23/57），與文獻報道一致[8]，略低于國外報道的59%～75%[9]。其中18株含有耐藥基因盒，攜帶率為31.6%（18/57）。Ⅰ類整合子陽性菌株耐藥譜明顯寬于陰性菌株，說明Ⅰ類整合子與細菌多重耐藥存在著密切關系[10～12]。

檢測出的耐藥基因盒均為Ⅰ類整合子常見基因盒[13]。18株沙門氏菌Ⅰ類整合子基因盒陽性株共含有7種不同的耐藥基因，其中，氨基糖苷類藥物耐藥基因檢出4種，與已有報道Ⅰ類整合子攜帶aadA基因盒一致[14，15]，基因檢測結果與耐藥表型基本一致。

通過分析藥敏試驗與基因檢測結果，得出所有Ⅰ類整合子基因盒陽性株均對磺胺異惡唑耐藥。復方新諾明中含有另外一種成分——甲氧芐啶，dfr基因編碼二氫葉酸合成酶，介導甲氧芐啶耐藥，對復方新諾明耐藥的菌株均檢測到dfr基因。因此，臨床用藥時需注意聯合用藥和輪換用藥并行。

本次檢出的沙門氏菌Ⅰ類整合子含有的耐藥基因盒可以解釋沙門氏菌分離株對氨基糖苷類、磺胺類藥物的耐藥性，但對于耐藥性較高的四環素類和喹諾酮類卻未檢測出相應的耐藥基因盒。因此，Ⅰ類整合子攜帶的耐藥基因盒還不能完全解釋沙門氏菌所有的耐藥表型，可能存在著其他機制共同介導沙門氏菌耐藥表型，如其他類整合子攜帶的耐藥基因盒、抗生素作用的靶位改變、細胞膜通透性改變、轉座子介導耐藥等。

整合子-基因盒系統在耐藥基因捕獲和轉移中發揮重要作用[16]。研究動物源性細菌整合子-基因盒系統介導的耐藥機制是控制細菌耐藥性傳播的根源途徑。本試驗從豬源沙門氏菌中檢測出了整合子及耐藥基因盒的存在，從分子水平分析細菌耐藥性獲得及傳播方式，為我國動物源性細菌耐藥性傳遞研究積累基礎資料，為指導貴州省規模豬場合理選擇用藥、制定干預細菌多重耐藥的產生及傳播措施提供了理論依據。

參 考 文 獻：

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