不明原因復發性自然流產患者FOXP3基因蛋白表達與啟動子甲基化水平之間關系的研究

侯文匯 李銀廣 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游澤山

基礎研究論著

不明原因復發性自然流產患者FOXP3基因蛋白表達與啟動子甲基化水平之間關系的研究

侯文匯 李銀廣 李珠玉 李婕 方利元 李小青 游澤山

目的探討不明原因復發性自然流產(URSA)患者蛻膜組織中叉頭樣轉錄因子P3(FOXP3)基因的蛋白表達水平及其與啟動子甲基化水平的關系。方法利用蛋白印跡法檢測20例URSA患者(URSA組)和20名正常妊娠主動要求人工流產術的健康婦女(正常對照組)蛻膜組織中FOXP3蛋白表達情況，利用結合重亞硫酸鹽的測序法(BSP)檢測2組FOXP3基因啟動子甲基化情況，并分析兩者的相關性。結果URSA組蛻膜組織中FOXP3表達水平明顯低于正常對照組(P<0.01)。BSP顯示URSA組FOXP3基因啟動子甲基化水平明顯高于正常對照組(P<0.01)。FOXP3蛋白表達水平與FOXP3基因啟動子甲基化水平呈負相關(r=-0.917，P<0.01)。結論FOXP3基因啟動子甲基化水平升高后，FOXP3基因蛋白表達水平下調，引起免疫耐受異常，可能導致RSA的發病。

不明原因復發性自然流產；叉頭樣轉錄因子P3；基因啟動子；甲基化

復發性自然流產(RSA)是指連續2次或2次以上(與同一性伴侶)的自然流產，其病因較復雜，除胚胎或流產夫婦的染色體異常、解剖異常、內分泌異常、感染等傳統經典的四大原因外，約有40%～50%的患者原因不明，稱原因不明RSA(URSA)。國內外研究表明，RSA與母胎免疫耐受的異常有關[1]。調節性T細胞(Treg)在母胎免疫耐受形成中起關鍵性作用，且Treg的形成和功能發揮又需要叉頭樣轉錄因子P3 (FOXP3)基因的穩定持續和高水平表達[2-3]。有報道，URSA患者外周血和蛻膜組織中Treg細胞數量明顯減少且其功能受損，尤以蛻膜組織中明顯[4-5]。另有學者報道，URSA患者存在FOXP3基因的低表達[5]。然而筆者尚未見有文獻深入研究FOXP3基因低表達的內在機制。本研究試圖從FOXP3基因表觀遺傳學方面探討其表達下調的機制，進而為RSA的防治開辟新思路。

材料和方法

一、標本

1.URSA組

2012年至2014年在中山大學附屬第一醫院黃埔院區行清宮術的RSA患者，年齡25～41歲，中位年齡32歲。按以下標準納入：流產次數≥2次，流產均發生在孕12周以前，胚胎絨毛染色體核型正常，絨毛全基因組高通量測序無微缺失或微重復。排除常見的夫婦雙方染色體異常、女方生殖道畸形、基礎性激素及黃體功能異常、男方精液檢查異常。本研究選擇符合標準的20例患者作為實驗組。

2.正常妊娠主動要求人工流產患者(正常對照組)

同期在中山大學附屬第一醫院黃埔院區正常妊娠主動要求人工流產術的健康婦女，年齡25～41歲，中位年齡31歲，孕8～12周。按以下標準納入：至少有1次成功妊娠史，無自然流產或死胎史，此次B超顯示正常，絨毛染色體核型正常，絨毛全基因組高通量測序提示無微缺失或微重復。本研究選擇符合標準的20例患者作為對照組。

3.標本采集

于清宮術中取出2組患者的胎盤蛻膜組織，洗凈，迅速放入液氮中凍存，并轉入-80℃冰箱保存。本研究經中山大學倫理委員會批準，每位參與者均被詳細告知研究內容并簽署知情同意書。

二、主要試劑

包括基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)、DNA亞硫氫酸鹽處理純化試劑盒(Qiagen，德國)、DNA凝膠回收試劑盒(Qbiosource，美國)、Amp(Amresco，美國)、DH5a感受態細胞(廣譽生物，中國)、蛋白提取液(碧云天生物，中國)、十二羥硫酸鈉(SDS，廣州威佳)、甲醇 (廣州化學試劑廠)、吐溫-20(Sigma，美國)、脫脂奶粉(伊利)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio Rad，美國)、兔抗人FOXP3多抗(CST 美國)、辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗(博士德，中國)、ECL顯色試劑盒(凱基生物)，重蒸水由Millpore純水機制備，蛋白胨、酵母提取物均為英國Oxiod公司產品，2倍Fast Pfu酶預制混合物、T載體、T4 DNA 連接酶均為中國近岸生物科技有限公司產品，乙醇、氯化鈉等均為國產分析純試劑。

三、方法

1.蛻膜FOXP3蛋白表達水平的檢測

使用蛋白免疫法檢測。常規蛋白提取法提取蛻膜組織總蛋白，各組樣品分別取總蛋白50 μg，5%的Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白質，并將其轉移至PVDF膜上。5%的脫脂奶粉封閉，加入稀釋度為1∶1 000的一抗磷酸鹽緩沖液(PBS)常溫孵育2 h，以管家基因GAPDH(1∶1 500)為內對照。洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(稀釋度為1∶2 500)，常溫孵育1 h，洗膜5次后，用ECL發光液1 ml顯影，X光法曝光，成像系統進行光密度掃描，對結果進行統計學處理。

2.組織DNA的提取

按照基因組DNA提取試劑盒說明書所列的步驟在無菌條件下提取蛻膜組織DNA。

3.FOXP3基因啟動子甲基化的檢測

采用結合重亞硫酸鹽的測序法(BSP)，對所提取的DNA進行亞硫酸氫鹽處理，步驟參照DNA亞硫氫酸鹽處理純化試劑盒說明書：將20 μl DNA樣品與150 μl的轉化試劑混合均勻，將混勻的轉化體系在PCR儀中98℃ 10 min，64℃放置5 h。將反應液與600 μl結合緩沖液混合，加到離心柱中，10 000×g離心30 s，棄濾液。加洗滌緩沖液200 μl，10 000×g離心30 s，棄濾液。65℃預熱洗脫緩沖液，將離心柱放入新的離心管中，加入30 μl洗脫緩沖液，10 000×g離心1 min，收集洗脫產物即為純化的甲基化處理的DNA樣品。用修飾后的DNA為模板進行PCR(上游引物5’-TATAATTAAGAAAAGGAGAAATATAGAGAG-3’；下游引物5’-TAAAACCCACATCTAATAAAAAAAA-3’)。總反應體系統50 μl：2倍Fast Pfu酶預制混合物25 μl，DNA模板5 μl，上、下游引物各2.5 μl，重蒸水15 μl。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s、62℃退火15 s、72℃延伸 30 s，共40個循環，最后72℃延伸5 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外燈下切下目的條帶。將凝膠回收的PCR產物連接入T載體，轉化DH5a感受態細胞，涂布APM抗性的LB固體培養基，37℃過夜培養。挑取陽性克隆10個，送往上海捷瑞生物工程有限公司進行測序。研究表明，FOXP3基因在啟動子區(-250 ～ +1 bp)，存在8個高度保守的CpG二核苷酸甲基化位點，經亞硫酸氫鹽修飾后未甲基化的胞嘧啶(C)均被轉換為胸腺嘧啶(T)，而被甲基化的C未被轉化。比較2組蛻膜組織的FOXP3基因CpG位點甲基化水平。

四、統計學處理

結 果

一、URSA組與正常對照組蛻膜組織的FOXP3蛋白水平比較

URSA組蛻膜組織的FOXP3蛋白表達水平低于正常對照組(0.525±0.135vs. 0.817±0.191，t= 4.782、P<0.01)，見圖1。

圖1 URSA組與正常對照組蛻膜組織的FOXP3蛋白表達水平比較

二、URSA組與正常對照組蛻膜組織的FOXP3基因甲基化水平比較

URSA組FOXP3基因甲基化位點甲基化水平明顯高于對照組(0.859±0.059vs. 0.712±0.099，t= 5.673、P< 0.01)，見圖2。

圖2 URSA組與正常對照組蛻膜組織的FOXP3基因啟動子甲基化水平比較

三、FOXP3蛋白表達與基因甲基化的關系

FOXP3蛋白表達水平與基因甲基化水平呈負相關(r=-0.917，P<0.001)。

討 論

研究表明，正常妊娠是一種成功的半同種異體移植現象，其關鍵在于母胎免疫耐受的形成使孕婦對胚胎半同種異體抗原不產生排斥反應。因此免疫耐受一旦被打破，就可能出現RSA等不良妊娠現象[6]。研究表明，RSA與免疫耐受有關[1]。Treg尤其是CD4+CD25+T細胞在母胎免疫耐受的形成過程中起關鍵性作用。最近，有學者提出用一種更合理、更符合自然流產發病原因復雜和多變性的模式，闡釋免疫耐受異常導致RSA的發病機制，即免疫調節相關Th1/Th2/Th17/Treg細胞模式：自然流產患者外周血及蛻膜組織中在免疫耐受的誘導和維持中發揮關鍵性作用的Treg細胞明顯低于正常妊娠者，而分泌多種促炎因子的Th1及Th17細胞明顯升高，這打破了正常妊娠的免疫耐受模式而導致自然流產的發病[7-11]。

FOXP3屬于人類轉錄調節因子之一，特異性的表達于CD4+CD25+T細胞。FOXP3基因的穩定持續和高水平表達是Treg的形成和功能發揮的關鍵[2-3]。梅珊珊等[12]研究發現，URSA患者外周血和蛻膜組織中Treg 細胞FOXP3表達比例低于正常早期妊娠婦女，且蛻膜局部FOXP3的變化較外周血更為靈敏。楊卉等[13]分別用免疫組織化學染色法、半定量和實時定量PCR法和蛋白免疫印跡法檢測，發現URSA患者蛻膜組織中FOXP3表達明顯低于正常早期妊娠婦女。本研究采用蛋白免疫印跡法分別檢測URSA患者和正常早期妊娠婦女蛻膜組織的FOXP3表達，URSA組明顯低于正常對照組，與前述報道基本一致。由此推測。FOXP3可能參與母胎界面妊娠免疫調節，其蛻膜組織中表達下降可能與RSA的發生有關。

然而FOXP3下調引起URSA具體的發生機制仍不明確。近年研究表明FOXP3長期和穩定的存在離不開以DNA 甲基化為代表的表觀遺傳學調控。已有研究證實，人類自然Treg中FOXP3的穩定表達需要以DNA甲基化為基礎的表觀遺傳學修飾來控制。余鑫海等[14]研究發現，原發性干燥綜合征患者Treg中FOXP3表達下調，其機制與FOXP3基因啟動子區CpG島甲基化有關。然而，目前國內外文獻尚未見關于URSA患者甲基化水平的報道。本研究采用BSP法檢測2組蛻膜組織FOXP3基因啟動子區域甲基化水平，結果顯示URSA組蛻膜FOXP3基因啟動子區域甲基化水平明顯高于正常對照組，且FOXP3蛋白表達水平與基因啟動子區甲基化水平呈負相關，提示在RSA的發生、發展過程中，FOXP3基因啟動子區域發生了甲基化，導致蛋白表達的減少或缺失，進而導致Treg細胞不能發揮免疫抑制作用，不利于正常母-胎免疫耐受的形成，從而導致RSA的發病。

綜上所述，本研究初次從表觀遺傳學角度討論URSA患者蛻膜組織FOXP3低表達可能由FOXP3基因啟動子高水平的甲基化引起，使Treg免疫抑制功能受損，打破母胎免疫耐受，導致RSA的發病。

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AssociationbetweenFOXP3promotermethylationandtheexpressionofFOXP3proteininunexplainedrecurrentspontaneousabortion

HouWenhui，LiYinguang，LiZhuyu，LiJie，FangLiyuan，LiXiaoqing,YouZeshan.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China

，YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

ObjectiveTo investigate the association between the level of FOXP3 promoter methylation and the expression level of FOXP3 protein in the decidua of patients with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA).MethodsThe expression levels of FOXP3 protein in the decidua of 20 URSA patients and 20 healthy counterparts who underwent induced abortion were assessed by Western blot. Bisulfite-assisted genomic sequencing PCR (BSP) was utilized to detect the levels of FOXP3 promoter methylation. The correlation between two indexes was evaluated.ResultsThe expression level of FOXP3 in the decidua of the URSA group was significantly lower than that of the control group (P<0.01), whereas the level of FOXP3 promoter methylation in the URSA group was significantly higher compared with that in the control group(P<0.01). The expression level of FOXP3 protein was negatively correlated with the level of FOXP3 promoter methylation (r=-0.917,P<0.01).ConclusionAs the level of FOXP3 promoter methylation increases, the expression level of FOXP3 protein is down-regulated, which may cause abnormal immune tolerance and potentially lead to the incidence of RSA.

Unexplained recurrent spontaneous abortion; FOXP3; Promoter; Methylation

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.09.006

廣東省自然科學基金(S2011010003522)

510080 廣州，中山大學附屬第一醫院婦產科(侯文匯，李銀廣，李珠玉，李婕，李小青，游澤山)；510010 廣州，廣東省婦幼保健院(方利元)

，游澤山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

2015-04-23) (本文編輯：林燕薇)