額爾敦-烏日勒及其優化方對家兔動脈硬化易損斑塊中MMPs 的活性調節作用△

都格爾 麻春杰 烏蘭其其格 蓮 花

(1.內蒙古國際蒙醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010065; 2.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010110)

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)易損斑塊(Vulnerable Plaque，VP)是指不穩定和有血栓形成傾向的斑塊，具有破裂傾向、易于發生血栓形成和(或)進展迅速的危險斑塊［1］。大量研究表明，約70% 至80% 的AS 血栓形成(Atherothrombosis)是由于輕、中度狹窄的動脈斑塊的破裂、繼發血栓形成所致，動脈粥樣硬化血栓形成疾病以高發病率、高致殘率、高死亡率、高復發率、并發癥多等成為全球性的重負和世紀的挑戰。根據有關報告，由動脈粥樣硬化血栓形成導致的死亡占人群總死亡的28.7% ～52%［2］，因此，穩定易損斑塊是防治動脈粥樣硬化血栓形成性疾病的關鍵，亦是目前醫學界防治心腦血管急性事件發生的重要目標。大量研究證明，血清基質金屬蛋白酶(matri metalloproteinase，MMPs)是造成斑塊不穩定的重要原因之一。MMPs 是一組可消化細胞外基質(ECM)的重要酶類，它通過降解纖維帽成分，破壞其結構加速斑塊破裂導致ACS 發生［3］。蒙藥額爾敦-烏日勒(珍寶丸)以其確切的療效和安全、低毒等優勢和鮮明的蒙醫藥特色、獨特的主治功效，在臨床中起到重要作用。在防治心腦血管疾病方面有潛在價值，已引起學者們的關注。近些年對額爾敦-烏日勒的研究逐步深入，臨床研究表明其治療心腦血管疾病療效顯著［4，5］。前期研究表明，額爾敦-烏日勒具有顯著的調節血脂，改善血液流變學可能是其抗AS 作用機制之一，還能夠有效干預動脈粥樣硬化的形成和發展［6］，具有消退早期動脈粥樣硬化的作用，可能通過降脂、抗炎等途徑發揮作用［7］。在實驗研究中發現，額爾敦-烏日勒與陽性對照藥阿司匹林［8］和辛伐他汀［6］有相似的作用，甚至有的作用優于辛伐他汀。因此我們，通過觀察額爾敦-烏日勒及其優化方對家兔AS-PV 對MMPs 活性與表達的調節作用，探討額爾敦-烏日勒及其優化方抗AS-PV 的作用機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 額爾敦-烏日勒［9］：內蒙古蒙藥股份有限公司;國家準字：Z15020410;規格：2g/10 粒，30 粒/瓶;生產日期：2012-07-12;產品批號：120706;有效期：至2015-06。額爾敦-烏日勒優化方：與額爾敦-烏日勒同樣標準。辛伐他汀片：山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司;國家準字：H20083840;生產日期：20121007;規格：20mg/片，12 片/1 板，板/盒;有效期：20141006。青霉素鈉注射液：華北制藥股份有限公司;國家準字：H13020655;生產日期：20120716;規格：160 萬單位/瓶×50 瓶/盒;有效期：201406。肝素鈉注射液，d 津生物化學制藥有限責任公司;執行標準：國家準字：H12020505 生產日期：20121007;規格：1.25 萬單位/2ml，2ml /支，2ml ×10 支/盒;有效期：20141006。3%戊巴比妥納注射液，胎牛血清白蛋白(Albumin Bovine fraction V)：上海生物工程有限公司，雞蛋黃、豬油、膽固醇：北京愛普華美生物科技有限公司生產，批號：20120715;血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)測試盒均購自南京建成生物技術有限公司。Trizol 試劑來源invitrogen，貨號15596-026;DEPC 處理水試劑來源上海基爾頓生物，貨號BYL40387;氯仿HPLC 級試劑、異丙醇HPLC 級試劑、無水乙醇AR 級試劑來源均購自上海國藥集團;SYBRGreen PCR 試劑盒來源Thermo，貨號F-415XL;逆轉錄試劑盒來源Thermo，貨號#K1622。

1.2 動物 健康新西蘭白兔，雄性，體重(2.0 ±0.2)kg，90只。由北京市海淀區興隆實驗動物養殖廠提供(許可證編號：SCXK(京)2012-0005，防疫合格證號20120038)，試驗在內蒙古醫科大學蒙藥研究院動物實驗中心完成。實驗條件：(18 ±2)℃，相對濕度(40 ± 15)%。

1.3 主要儀器 日立7180 型全自動生化分析儀：制造商—日本株式會社日立高新技術(日本國東京港區西新橋—丁目24 盤14 號);球囊擴張導管(人用)：導引導管規格：145cm×0.84mm，導引導絲規格：145 ×0.36mm，球囊規格：20 ×2.5，テルモ株式會社(日本)，REF/コ—ド番號：DC-RH2520EHW，LOT/制造番號：120209，有效期：2015-01］;壓力泵：規格：20ml 美國麥瑞，PL303 電子d 平，國內dna 擴增儀：1109 型北京新技術所機械臂變溫水浴電子調溫40 ×0.5ml，國外dna 擴增儀：dna thermal cycler perkin –elmercetus(美)變溫鋁塊壓縮機致冷48 × 0. 5mlus $20000.-。試劑儲存、標本制備和基因擴增與產物分析一起用品：2-8℃和-15℃冰箱，混勻器，微量加樣器(覆蓋1-1000μl)，移動紫外燈(近工作臺面)，高速臺式冷凍離心機，超聲波水浴箱或加熱模塊，全自動定量核酸擴增儀(含計算機、打印機)。消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心)。TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器制造廠;旋渦振蕩器：上海青浦瀘西儀器廠XW-80A;手握式電動勻漿機：德國FLUKO(F6-10);低溫冷凍離心機：Sigma(3K15);移液器：吉爾森P 型移液器(Pipetman);Real- time 檢測儀：ABI (ABI-7300)。酶標儀：芬蘭(Labsystems Multiskan MS)，儀器型號：352 型;洗板機：芬蘭(Thermo Labsystems)，儀器型號：AC8;離心機：微量高速離心機(國產)，儀器型號：TG16W;培養箱：隔水式恒溫培養箱(國產)，儀器型號：GNP-9080型。

2 方法

2.1 家兔分組喂養 取90 只家兔，所有均單籠喂養，普通飼料適應性喂養1wk 后，按抽簽法隨機分為正常對照組(10 只)與造模組(80 只)。正常對照組喂普通飼料，每只予150g·d-1，造模組喂高脂飼料(1.0%膽固醇、5.0%豬油、5.0%蛋黃粉、89%基礎飼料)，每只予150g(普通飼料50g、高脂飼料100g)·d-1，自由攝食，正常對照組與造模組分別灌胃蒸餾水，飲水不限，取材截止。

2.2 造模分組給藥：造模組則采用下述方法建模。病變接近于人體不穩定斑塊病變的發生發展過程的相對操作簡單、造模成功率高、成本低、重復性好的建模方法［10］，將造模組選取采用復合因素(采用高脂飲食加免疫損傷和球囊拉傷方法)建模［11］，成功建立符合VP 病理形態學特征的動物模型。從實驗第1wk 開始按造模組家兔喂養法給予高脂飼料，取材截止。第2wk 時(高脂飼料1wk 后)予造模組家兔經耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/mL/kg。第4wk 行經股動脈球囊拉傷術，術前12 h 禁食不禁水，以3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 經耳緣靜脈麻醉后將動物固定于手術臺。左側腹股溝wk 邊區域剪毛常規皮膚消毒，沿股動脈走行切開皮膚，分離皮膚和皮下組織，分離股動脈約2 cm。結扎動脈遠端，用手術絲線提起動脈近心端阻斷近端血流。在動脈壁上約呈450“v”形剪開一小口，逆行插入肝素生理鹽水(1：15 稀釋)沖洗過的球囊導管(內置鋼絲引導)至胸主動脈處。送入約20cm，抽出導絲，連接于50 mL 注射器，注入約20-30 mL 空氣，使球囊內壓力達到約2 個大氣壓。維持此狀態緩慢拉出導管至其10cm 刻度處，然后回抽注射器解除球囊內壓力，即有較強的阻力感繼而突然的落空感即可。重新插入導管，再牽拉1 次，以確保內膜拉傷，反復2 次后撤出導管，結扎近心端。逐層縫合皮下組織和皮膚，青霉素鈉注射液沖洗創面。約8wk(確定模型成功后)將造模組隨機分為模型組(20 只)，額爾敦-烏日勒組(20 只)和額爾敦-烏日勒優化方組(以下稱為：優化方組)(13 只)，辛伐他汀組(15 只)。分別給予相應藥物干預，給予額爾敦-烏日勒及其優化方組家兔各0.4g/kg/d;給予辛伐他汀組家兔各5mg/kg/d。繼續予以高脂飲食，24wk 取材截止。

2.3 收集標本：取材前12h 禁食，用3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg 經兔耳緣靜脈麻醉后，固定于手術臺上，用50 mL 注射器體外心臟采血，3000 r/min 離心10 min 后提取血清，血清貯存于-80°C 冰箱中備用;備用;經耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔，取其主動脈、心臟、肝臟和腎臟等器官臟器，常規處理，為它項檢測備用。

2.4 統計學分析：應用SPSS 13.0 統計軟件進行數據統計學處理。采用ANOVA 方差分析并行方差齊性檢驗，兩組均數間比較采用t 檢驗，結果以均數加減標準差(±s)表示，以P＜0.05 為有顯著性差異。

3 結 果

3.1 一般狀況：每d 喂養、灌藥觀察當中，家兔除了用于預實驗和死亡以外，其余正常對照組家兔：精神狀態良好，行為活動、反應靈敏，毛色較白有光澤，目睛光亮有神，飼喂時不斷抓撓食盒，攝食、飲水、糞便未見明顯異常。模型組家兔：從5wk 左右開始發現精神欠佳，目光呆滯，活動少，飲食可;8wk 左右飼喂時較少有反應，喜臥少動，飲食有所減少，毛色變暗;10wk 左右發現目睛混濁，可見有脂肪沉積，飲食略有增加;至12wk 時精神差，對外界刺激反應遲鈍、多寐、飲食尚可、余同前。30d 稱體重一次，模型組與正常對照組體重隨時間變化呈增長趨勢，但同一時間點兩組間體重比較差別不大，無統計學意義(P＞0.05)。可以證實此造模因素基本未影響模型兔的正常生長，見表1。

表1 正常組與模型組家兔體重比較(±s，㎏)

表1 正常組與模型組家兔體重比較(±s，㎏)

注：模型組與正常對照組比較，P ＞0.05

組類 樣本數 第一個月 第二個月 第三個月 第四個月正常組9 2.5 ±0.20 2.83 ±0.17 3.22 ±0.16 3.61 ±0.31模型組19 2.5 ±0.14 2.91 ±0.18 3.36 ±0.19 3.97 ±0.16

3.2 血清MMPs 活性檢測結果 采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay 簡稱ELISA)法檢測出各組家兔血清MMP-1、MMP-2、MMP-9 的活性，見表2。

表2 各組家兔基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比較(μg/L，± s)

表2 各組家兔基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)活性的比較(μg/L，± s)

注：模型組與正常組比較，* P ＜0.05;各給藥組與模型組比較，△P ＜0.05;與辛伐他汀組比較﹟P ＜0.05。

組別MMP1 MMP2 MMP9正常組n 12.320 ±0.1508 21.855 ±2.349 61.900 ±7.673模型組 8 19.291 ±0.2459* 27.505 ±0.438* 65.564 ±0.676*辛伐他汀組 8 13.939 ±0.1961△ 23.488 ±0.435△ 59.485 ±0.930△額爾敦-烏日勒組 10 9.873 ±0.1269△﹟ 20.356 ±0.399△﹟ 54.072 ±0.535△額爾敦-烏日勒優化方組8 17.184 ±0.4459 25.645 ±0.338 63.463 ±1.235 8

圖1 各組血清MMP-1 的活性指標比較圖

各組家兔血清MMP-1 的活性指標比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優化方組無顯著性差異。見圖(1)和表2。

圖2 各組家兔血清MMP-2 的活性指標比較圖

各組家兔血清MMP-2 的活性指標比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優化方組無顯著性差異，見圖(2)和表2。

圖3 各組家兔血清MMP-9 的活性指標比較圖

各組家兔血清MMP-9 的活性指標比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒優化方組無顯著性差異，見圖(3)和表2。

3.3 檢測主動脈MMPs 基因表達結果：從各組隨機取出家兔主動脈組織樣本，采用實時定量熒光聚合酶鏈式反應(real-time quantitative PCR)技術檢測出MMP-1、MMP-2、MMP-9 的基因表達水平。各組家兔基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達結果的比較如下：

表3 各組家兔基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達的比較(± s)

表3 各組家兔基質金屬蛋白酶(MMP1、MMP2、MMP9)基因表達的比較(± s)

注：模型組與正常組比較，* P ＜0.05;各給藥組與模型組比較，△P ＜0.05;

分組MMP1 MMP2 MMP9正常組0.0202 ±0.0045 0.0238 ±0.0048 0.0057 ±0.0014模型組 0.0495 ±0.0063* 0.0519 ±0.0018* 0.0117 ±00.0022*辛伐他汀組 0.0290 ±0.0088△0.0243 ±0.0032△0.0073 ±0.0012△額爾敦-烏日勒組0.0285 ±0.0082△0.0232 ±0.0070△0.0069 ±0.0006△

圖4 各組家兔主動脈MMP-1 基因表達水平比較圖

各組家兔主動脈MMP-1 的基因表達水平比較：與正常組比較，模型組MMP-1 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖(4)與表3。

圖5 各組家兔主動脈MMP-2 的基因表達水平比較圖

各組家兔主動脈MMP-2 的基因表達水平比較：與正常組比較，模型組MMP-2 明顯升高P＜0.05;與模型組相比，額爾敦-烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間無顯著性差異(P＞0.05)。見圖(5)與表3。

圖6 各組家兔主動脈MMP-9 的基因表達水平比較圖

各組家兔主動脈MMP-9 的基因表達水平比較，與正常組比較，模型組MMP-9 明顯升高(P＜0.05);與模型組相比，額爾敦- 烏日勒組和辛伐他汀組明顯降低(P＜0.05)，其中額爾敦-烏日勒組與辛伐他汀組間有顯著性差異(P＞0.05)，見圖(6)與表3。

4 小結

在成功建立造模基礎上，分別給予相應藥物干預，以辛伐他汀作對照，觀察額爾敦-烏日勒及其優化方對實驗性家兔AS-VP 的MMPs 的調節作用。實驗結果顯示，額爾敦-烏日勒能顯著降低血清MMP-1、MMP-2 和MMP-9的活性，減少主動脈MMP-1、MMP-2 和MMP-9 的基因表達，表明額爾敦-烏日勒及其優化方對MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)具有顯著的調節作用，從本實驗看，額爾敦-烏日勒及其優化方調節MMPs(MMP-1、MMP-2和MMP-9)活性作用可能優于辛伐他汀。因此，通過本實驗，我們認為額爾敦- 烏日勒及其優化方可能通過降低MMPs(MMP-1、MMP-2 和MMP-9)活性和基因表達而起到穩定AS-VP 的作用。

［1］Naqhavi M，Libby P，Falk E，etal. From vulnerable plaque to vulnerable patient：A call for new defi nition and risk assessment strategies：part I［J］. Circulation，2003，108：1664-1672.

［2］許俊堂，胡大一. 動脈粥樣硬化血栓形成［J］. 中國醫刊.2006，41(7)：4-5.

［3］Morishige K，Shimokawa H，Matsumoto Y，et al . Over expression of ma2 trixmetalloproteinase-9 promotes intravascular thrombus formation in porcine coronary arteries in vivo［J］. Cardiovasc Res，2003，57 (2)：5722585.

［4］邊小華. 治療薩病的體會［J］.中國蒙醫藥，2010，(1)∶53.

［5］查干夫，塔娜.腦梗治驗［J］.中國蒙醫藥，2010，(5)∶38.

［6］董平，麻春杰，都格爾，等.額爾敦-烏日勒對實驗性家兔動脈粥樣硬化的影響［J］.中華中醫藥學刊，2011，29(5)：1012，1015.

［7］麻春杰，都格爾，等.額爾敦-烏日勒在家兔動脈粥樣硬化斑塊消退中的作用及其對炎癥因子的影響［J］. 世界科學技術—中醫藥現代化，2011，13(5)∶ 894-898.

［8］麻春杰，韓雪梅，圖門巴雅爾，等.加減補陽還五湯和額爾敦-烏日勒對大白兔腦缺血的保護作用及血液流變性的影響［J］.中醫藥學刊，2002，20(2)：222，237。

［9］中華人民共和國衛生部藥典委員會. 中華人民共和國衛生部藥品標準蒙藥分冊［S］.1998，160。

［10］張軍平，彭立，李良軍，等.實驗性兔AS-VP 模型的建立及評價［J］. 中國實驗動物學報，2009，17(3)161-165。

［11］張軍平，許穎智，李良軍，等.實驗性兔AS 模型復合建模的方法及評價［J］. 中國比較醫學雜志，2009，19(1)：42-45。