Survivin，caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達程度分析

胡一迪,胡孝渠,李權,喻明霞

(1.溫州醫科大學 臨床系，浙江 溫州，325000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.武漢大學 基礎醫學系，湖北 武漢 430072)

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Survivin，caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達程度分析

胡一迪1,胡孝渠2,李權2,喻明霞3

(1.溫州醫科大學 臨床系，浙江 溫州，325000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 腫瘤外科，浙江 溫州 325000；3.武漢大學 基礎醫學系，湖北 武漢 430072)

目的 探討survivin、caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達程度及其意義，為乳腺相關疾病的診斷和治療提供科學依據。方法 選取溫州醫科大學附屬第一醫院腫瘤外科手術切除病理標本人乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌病例蠟塊標本，用免疫組化法(SP)檢測survivin和caspase-8在各病理類型組織中表達的情況。結果 在乳腺增生乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin表達的陽性率分別為(89.00±1.38)%、(89.85±1.55)%和(85.72±1.10)%)，3組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)；caspase-8在乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌表達的陽性率分別為(75.03±1.32)%、(73.59±1.08)%和(72.80±1.17)%，3組兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論 Survivin在3種乳腺相關疾病中的表達程度由高到低依次為乳腺癌癌前病變> 乳腺增生>乳腺癌；caspase-8在3種乳腺相關疾病中的表達程度由高到低依次為乳腺增生>乳腺癌癌前病變>乳腺癌。Survivin和caspase-8的聯合檢測有助于對3種疾病的診斷提供參考依據。

乳腺增生；乳腺癌癌前病變；乳腺癌； survivin；caspase-8

Survivin為凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis proteins，IAP)，能夠抑制細胞凋亡和調節細胞的分裂，可在常見的多種惡性腫瘤中表達，且表達與病程進展相關，比如，宮頸癌、黑色素瘤、III～IV期神經母細胞瘤以及淋巴瘤等[1-3]，但是不在成人正常組織和癌旁正常組織中表達[4]。在生理的狀態下，只在成人分泌期子宮內膜、胚胎、胎盤和睪丸之中表達。

Caspase蛋白激酶為凋亡的執行、調控蛋白。與正常的細胞相比較，caspase-8在腫瘤細胞中的表達處于缺失或者抑制狀態，但是此類缺失為細胞無法啟動和最終凋亡的一個重要原因[5]。研究表明，在腫瘤細胞中的caspase-8并不是完全缺失，而且臨床預后同表達的高低有非常密切的關系[6-7]。

最新的研究表明，并非全部caspase-8高表達的細胞自身都會發生凋亡，也非所有癌細胞內的caspase-8都有缺失。本研究對survivin和caspase-8在人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達程度進行了分析，以期為survivin和caspase-8對腫瘤細胞具體作用機理的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標本 本課題實驗所選取的臨床病例及標本均已取得了患者及其家人的知情同意,并簽署知情同意書，且通過本醫院倫理委員會的批準。收集2010年9月～2013年9月溫州醫科大學附屬第一醫院的乳腺手術標本。蠟塊存檔共90例，均是女性患者。取乳腺腫塊，病理診斷為乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌，術前均未經放化療及免疫治療的標本蠟塊。乳腺增生、乳腺癌和乳腺癌癌前病變均為30例。采用切片機對標本蠟塊連續橫斷面的切片處理。每一個蠟塊切取2張切片，片厚為4 μm，總共180張。

1.2 主要試劑 Caspase-8抗體、兔抗人survivin抗體(北京中山生物工程公司)；原位凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.3 玻片的處理與切片 硫酸清潔液浸泡玻片5 h，用流水沖洗20 h。鉻礬明膠作防脫片處理洗凈烤干后的玻片。玻片經蒸餾水清洗后，于95%的乙醇中浸泡過夜。撈出95%乙醇中的玻片，置于片架上，再放入45 ℃烤箱內，烤1 h左右至干。在70 ℃的100 mL去離子水中溶解0.59 g優質明膠，冷卻至室溫。明膠的溶液中加入50 mg KCrSO4·12H2O，配成鉻礬明膠。冰浴至4 ℃后再使用鉻礬明膠。

鉻礬明膠中浸泡清潔后的玻片1 min。取出玻片，置于玻片架上。放置在45 ℃的恒溫箱中，過夜，玻片備用。標本都要經過連續的切片，厚度為4 μm，放于備用玻片上。為使組織緊貼于玻片，玻片放于60 ℃的烤箱中烤1 h。

1.4 SP法檢測caspase-8和survivin蛋白的表達 采用SP法，按照試劑盒的說明要求進行操作。抗caspase-8抗體稀釋度為1:50，兔抗人survivin抗體稀釋度為1:20。DAB染色后蘇木素復染，在顯微鏡下觀察判斷結果。

1.5 免疫組化結果評判標準 以背景清晰，排除非特異染色為前提。陽性結果即組織細胞核呈現明顯棕黃色染色，陰性結果即無棕黃色染色。陽性的表達在高倍光鏡下觀察。選擇40倍物鏡，在高倍鏡下選取5個視野。陽性表達率的計算方法如下(為避免隨意性，每張切片的代表性區域選取不同視野的平均值)：陽性表達率=陽性細胞數/總細胞數×100%。

2 結果

2.1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的陽性表達率 Survivin在不同組織中表達不同，表達程度由高到低依次為乳腺癌癌前>乳腺增生>乳腺癌，3組兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的陽性表達率±s)

△P<0.05，與乳腺增生比較，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，與乳腺癌癌前病變比較，compared with breast precancerous lesion

圖1 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中survivin的表達Fig.1 Expression of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

2.2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的表達 Caspase-8在不同組織中表達不同，表達程度由高到低依次為乳腺增生>乳腺癌癌前>乳腺癌，3組兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的陽性表達率±s)

△P<0.05，與乳腺增生比較，compared with breast hyperplasia；#P<0.05，與乳腺癌癌前病變比較，compared with breast precancerous lesion

圖2 乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中caspase-8的表達Fig.2 Expression of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer

3 討論

本實驗采用免疫組化方法對人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的survivin、caspase-8的表達進行了分析，發現3者中survivin、caspase-8的陽性表達率兩兩之間均有統計學意義(P<0.05)。Survivin在乳腺癌中的表達程度最低，在乳腺癌癌前病變表達程度最高，在乳腺增生中表達程度較低；caspase-8在乳腺增生中的表達程度最高，在乳腺癌癌前病變中表達較低，在乳腺癌中表達程度最低。

細胞凋亡機制的紊亂和乳腺增生病、乳腺癌以及乳腺癌癌前病變3者的發生有密切的關系。細胞的凋亡受基因的調控，通過調節細胞存活期來發揮生物效應是其主要的作用機制。其中，正常組織細胞調節的重要機制即細胞凋亡。Survivin是抑凋亡基因，而caspase-8是促凋亡基因，2者是當今研究的較為重要的細胞凋亡的相關基因。有研究表明，survivin能夠抑制由caspase-8誘導caspase的活化，以及阻止caspase-3同caspase-7自發活化的作用[8]。

多種凋亡基因表達產物能夠影響腫瘤細胞的凋亡。積極治療乳腺增生可延緩、阻斷和逆轉癌前狀態，對于治療此病本身也有利。因此，重視乳腺增生病的診斷和治療，有著非常重要的意義。Survivin表達增高可抑制腫瘤細胞凋亡而促進其增殖，腫瘤病程的進展同survivin的表達密切相關[9]。從而，survivin可以成為檢測惡性腫瘤的指標，以及作為一種腫瘤標志物。

目前，仍然沒有證據表明IAP直接導致腫瘤的發生，然而，其在腫瘤發病機制過程中發揮著重要作用。與其它IAP分子不同的是，survivin蛋白只有1個N-末端的重復序列(baculoviral IAP repeat，BIR)結構，卻無羧基環指的結構[- 11]。在終末分化的成人組織中檢測不到survivin，其廣泛表達于人類多種腫瘤組織，在人胚胎組織中高度表達并參與胚胎發育過程中的組織分化以及器官的形成。Survivin作為一種新的抗凋亡基因，具有成為檢測惡性腫瘤指標的巨大潛力，survivin可以誘導腫瘤細胞的自發性凋亡，引起細胞有絲分裂失敗，抑制腫瘤形成和生長[12-13]，survivin在腫瘤周圍正常的組織中沒有表達[14]，而在腫瘤組織中有表達。本實驗免疫組化結果表明，survivin的表達的細胞胞漿中主要為陽性染色，呈黃色到深棕黃色的顆粒狀。在正常乳腺組織和一般性增生的乳腺組織中，其沒有著色或者僅有輕度的著色；在乳腺癌組織和不典型的增生中，可以看見大部分的癌細胞以及增生細胞中，有不同程度著色。

某些惡性腫瘤發生的關鍵因素是survivin的表達，可以促進細胞表型惡性轉化[15-16]。乳腺增生病、乳腺癌癌前病變和乳腺癌的caspase-8表達有明顯差異，表現為逐漸降低。細胞發生轉化、惡變后survivin顯著增加表達。乳腺癌癌前病變survivin的表達最高，在乳腺增生病、乳腺癌中分別降低。Survivin可直接作用于caspase，抑制其活性[17]。當細胞發生轉化或者惡變時survivin表達顯著增加，在乳腺癌組織中同樣有高表達[18]，因此在乳腺病變中有重要影響。caspase-8 表達降低或基因突變與多種腫瘤的發生，發展及預后密切相關[19-20 ]。

綜上所述，caspase-8和survivin的表達程度與人體乳腺增生、乳腺癌癌前病變和乳腺癌的發生發展密切相關。對于survivin和caspase-8的聯合檢測可能有助于對乳腺癌惡性程度的判斷和侵襲能力進行評估，進而為乳腺癌的預后判斷以及合理的治療提供參考。

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(編校：王儼儼，吳茜)

Analysis of survivin and caspase-8 expression in human breast hyperplasia,breast precancerous lesion and breast cancer

HU Yi-di1,HU Xiao-qu2,LI Quan2,YU Ming-xia3

(1.Department of Clinic, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China; 2.Department of Surgical Oncology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China; 3.Department of Basic Medicine, Wuhan University, Wuhan 430072, China)

ObjectiveTo analyze the expression degree of survivin and caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer.MethodsThe wax block specimens of human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer cases from the first affiliated hospital of Wenzhou medical university were selected.The expression of survivin and caspase-8 in various pathological types in the organization were detected by the immunohistochemical method(SP).ResultsThe positive expression rates of survivin in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (89.00±1.38)%, (89.85±1.55)% and (85.72±1.10)%, respectively, the differences between every two groups were all significant (P<0.05); the positive expression rates of caspase-8 in human breast hyperplasia, breast precancerous lesion and breast cancer were (75.03±1.32)%, (73.59±1.08)% and (72.80±1.17)%, respectively, the differences between every two groups were all significant(P<0.05). ConclusionThe expression degree of survivin in three breast-related disease from high to low was breast precancerous lesion>breast hyperplasia >breast cancer; the expression degree of caspase-8 three breast-related disease from high to low was breast hyperplasia >breast precancerous lesion>breast cancer.The combination detection of survivin and caspase - 8 expression in tumor cells provides foundation for diagnose breast-related disease.

breast hyperplasia; breast precancerous lesion; breast cancer; survivin; caspase-8

2009博士點基金(20090141120025)

胡一迪，男，本科，主治醫師，研究方向：乳腺腫瘤，E-mail：hyd13957741890@163.com。

R36

A

1005-1678(2015)01-0100-03